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Title Page 1

Abstract 4

Contents 8

Ⅰ. 3D-printed scaffolds for tissue regeneration(emphasizes chemical cues and integrates with physical cues for a comprehensive analysis) 17

i) Strontium/silicon/calcium-releasing hierarchically structured 3D-printed scaffolds accelerate osteochondral defect repair 18

1. Introduction 18

2. Materials and methods 20

3. Results and discussion 31

4. Conclusion 81

ii) Therarchically structured 3D-printed scaffolds doped with cerium oxide nanoparticles modulate bone immunology to promote bone regeneration 82

1. Introduction 82

2. Materials and methods 83

3. Results and discussion 91

Ⅱ. Functionalized hydrogels for tissue regeneration(emphasizes physical cues and integrates with chemical cues for a comprehensive analysis) 0

Development of an injectable biphasic hyaluronic acid-based hydrogel with stress relaxation properties for cartilage regeneration 96

1. Introduction 96

2. Materials and methods 98

3. Results and discussion 108

4. Conclusion 143

Future direction 147

Reference 149

국문초록 161

List of Tables 13

Ⅰ. 3D-printed scaffolds for tissue regeneration(emphasizes chemical cues and integrates with physical cues for a comprehensive analysis) 13

i) Strontium/silicon/calcium-releasing hierarchically structured 3D-printed scaffolds accelerate osteochondral defect repair 13

Table 1. Primers used for qPCR 79

Table 2. The ion concentration in the extracts(n＝3 scaffolds/condition) 79

Table 3. Summary of the main contributing factors of the composite scaffolds on... 80

Ⅱ. Functionalized hydrogels for tissue regeneration(emphasizes physical cues and integrates with chemical cues for a comprehensive analysis) 13

Development of an injectable biphasic hyaluronic acid-based hydrogel with stress relaxation properties for cartilage regeneration 13

Table 4. Primer sequences for qPCR 144

Table 5. The contents of P and Ca in HA@Ca samples (100 mg × 3) by ICP-OES 144

Table 6. Code name, stiffness, and SR50 time values of the hydrogel according to the... 145

Table 7. Gelation times of each injectable hydrogel prepared by 4 wt. of HA@Ca... 146

List of Figures 14

Ⅰ. 3D-printed scaffolds for tissue regeneration(emphasizes chemical cues and integrates with physical cues for a comprehensive analysis) 14

i) Strontium/silicon/calcium-releasing hierarchically structured 3D-printed scaffolds accelerate osteochondral defect repair 14

Figure 1. Preparation and characteristics of hierarchically structured 3D-printed... 36

Figure 2. Evaluations showing Sr substitution for Ca in SrBGn. (a) EDS spectra and (b)... 37

Figure 3. Optimization of 3D-printed scaffold fabrication. Various 3D printing... 39

Figure 4. Surface morphology and topology of the hierarchically structured 3D-printed... 40

Figure 5. Sr substitution of bioactive nanoglasses enables multiple ion releases,... 44

Figure 6. Chemical surface properties of the 3D-printed scaffolds. (a) XPS survey... 46

Figure 7. Sr ion alone accelerates chondrocyte migration while it does not influence... 49

Figure 8. Multiple ion release from SrBGn-μCh enhances chondrocyte activity in vitro.... 51

Figure 9. Cellular respiratory capacity of chondrocytes treated with scaffold extracts. (a)... 53

Figure 10. Strontium ions released from SrBGn-μCh alter transcriptomics levels of... 59

Figure 11. Heatmaps displaying relative gene expression levels of DEGs associated... 61

Figure 12. In addition to the combined effect of multiple ions, nanotopological cues... 64

Figure 13. Composite scaffolds increase the proliferation, migration, and osteogenic... 68

Figure 14. In vivo, subcutaneous implantation of the composite scaffolds reveals that... 70

Figure 15. SrBGn-μCh accelerates cartilage and bone regeneration in an osteochondral... 74

Figure 16. (a, b) Enlarge images showing H&E, Masson's trichrome (MT), and... 77

Figure 17. A summary of how SrBGn-μCh enhances osteochondral defect repair.... 78

ii) Hierarchically structured 3D-printed scaffolds doped with cerium oxide nanoparticles modulate bone immunology to promote bone regeneration 15

Figure 18. (a) FE-SEM images showing the hierarchical structure of scafiblds at... 94

Figure 19. (a) ROS staining of MC3T3-E1 after H₂O₂ treatment on μCh and μCh-nCe.... 94

Ⅱ. Functionalized hydrogels for tissue regeneration(emphasizes physical cues and integrates with chemical cues for a comprehensive analysis) 15

i) Development of an injectable biphasic hyaluronic acid-based hydrogel with stress relaxation properties for cartilage regeneration 15

Figure 20. Preparation and remodeling properties of hydrogels. (a) Chemical structure... 112

Figure 21. Comparison of differences in room temperature viscosity of 4% hyaluronic... 113

Figure 22. Molecular weight comparison of hyaluronic acid derivatives by GPC... 113

Figure 23. Quantitative and qualitative characteristics of HA derivatives and their... 117

Figure 24. FTIR (a) and ¹HNMR (b) full spectra of hyaluronic acid derivatives 118

Figure 25. XPS analysis by remodeling characteristics of the P50 hydrogel : (a) XPS full... 118

Figure 26. (a) Adjustable stress-relaxation time ranges for each remodeling hydrogel, (b,... 119

Figure 27. Shape-forming images of injectable hydrogel (CP3; P150) 122

Figure 28. Physicochemical properties evaluation of hydrogel. (a) Photographs of... 123

Figure 29. Analysis of micro-pore size for each hydrogel; (a) CHH(2000), (b) CHL... 124

Figure 30. (a) cumulative diffusion profiles of remodeling hydrogels, (b) sample... 124

Figure 31. (a) Chondrocytes and (b) rBMSCs were encapsulated in separate hydrogel... 126

Figure 32. Effect of stress relaxation on the production of chondrocyte matrix. (a, b)... 130

Figure 33. Effects of stress relaxation and hydrogel composition on chondrocyte-related... 131

Figure 34. Chondrocytes were cultured in different hydrogels using a hyaline... 132

Figure 35. Effect of stress relaxation, stiffness, and composition of hydrogels on... 133

Figure 36. The transcriptome of stress relaxation and phosphate effect on chondrocytes.... 137

Figure 37. Effect of phosphate on chondrocyte production of chondrocyte matrix and... 140

Figure 38. Comparison (a) graph and (b) images of hydrogel degradation rate for 3... 142

Figure 39.(a) Images of type II collagen staining images showing the quality of... 142

초록보기

 골격 시스템은 포유류 몸체의 구조적 틀을 제공한다. 인간의 뼈는 근육, 힘줄, 인대에 중요한 첨부점을 제공하여 움직임을 촉진한다. 또한 뼈는 성인의 혈액 생성에 필수적인 미세 환경을 만든다. 더욱이, 뼈는 부상 복구, 뼈 발달, 그리고 성인기 동안의 지속적인 리모델링에 중요한 자기 재생 능력을 가지고 있다. 뼈 재생은 다양한 세포 유형과 세포 내외 분자신호 전달 경로를 참여시키는, 정확하게 조정된 일련의 골 유도 및 전도 생물학적 사건들을 포함하며, 수리를 최적화하고 뼈 기능을 복원하기 위해 정의된 시간적 및 공간적 순서를 가진다. 연골은 긴 뼈의 끝을 덮는 매우 전문화된 조직으로, 기계적 손상으로부터 뼈를 보호한다. 주로 히알루론산, II 형 콜라겐 (Col 2), 그리고 조직화된 연골세포로 채워진 프로테오글리칸이 풍부한 매트릭스로 구성 되었다. 그것의 탄력성 있고 매끄러운 표면 때문에, 연골은 하중 지지와 관절 윤활에 중요한 역할을 한다. 관절 연골 (AC)의 홈오스타시스는 프로테오글리칸과 콜라겐 함량을 균형있게 유지함으로써 유지되며, 구조적 무결성과 강도를 보장하면서 뼈 사이의 마찰을 줄이고 하중을 분산시키는 매끄러운 관절 운동을 촉진한다.

그런데 뼈와 연골의 손상은 심각하게 신체 기능을 손상시키고 환자의 생활 질을 저하시키는 대표적인 질환 상태이다. 뼈 치유는 사람의 생애 동안 지속되는 동적인 과정으로, 엄격한 규제와 신중한 조정이 특징이지만 쉽게 방해받는다. 성인기에도 일부 회복 능력이 지속되지만 뼈를 재생하는 능력은 나이가 들면서 크게 감소하여 뼈 재생을 촉진하는 효과적인 치료법이 필요하다. 현재 많은 뼈 재생 전략이 상대적으로 만족스러운 결과를 가져왔지만, 그들은 단점과 제한 사항을 가지고 있어 그들의 효과성과 비용 효과에 대한 우려를 불러일으킨다. 또한 이종골 및 합성골은 자연 뼈에 우수하거나 동등한 생물학적 또는 기계적 속성을 가지고 있지 않다. 그리고 연골 결함은 주로 혈관과 신경이 없는 특성 때문에 재생 능력을 심각하게 제한하여 전 세계적으로 중요한 의료적 도전이다. 이러한 결함은 하부 연골 뼈까지 확장될 수 있어, 세계에서 가장 흔한 퇴행성 근골격 질환인 골 관절염으로 진행될 수 있다. 대략 5.28 억만 명의 사람들이 골관절염을 가지고 있으며, 이 환자들 중 약 73%는 55 세 이상이고 60%는 여성이다. 비만과 질환의 비율과 더불어 기대수명이 증가함에 따라, 골관절 관련 질환의 전 세계적인 발병률이 증가할 것으로 예상된다. 골관절 결함에서는 통증, 부종, 경직과 같은 임상적 특징이 나타나며, 이는 이동성을 방해한다. 다양한 치료 접근법이 개발되었으며 이들은 관절 연골의 손실을 특징으로 하는 초기 골관절염을 예방하고 치료하기 위한 완화, 복원, 재생 치료를 포함한다. 완화 치료는 무릎 통증을 완화하고 기능 상태를 개선하는 것을 목표로 하지만 연골 결함의 추가적인 진행을 막지는 않는다. 골수 자극 기법과 같은 복원 치료법은 연골 결함을 채울 수 있지만 결과적으로 생기는 조직은 섬유 연골로, 이는 자연 유리 연골에 비해 열악한 생체역학적 및 점탄성 속성을 가지고 있다. 자가 이식 또는 이종 이식의 도입은 심각한 골관절 결함을 치료하는데 유망한 해결책을 제시한다. 하지만 결함의 완전한 치유를 촉진하는 치료법은 존재하지 않으며, 특히 연골의 완전한 재생을 달성하는 것은 특히 그렇다.

조직 공학 분야는 빠르게 발전하고 있으며, 조직 손상을 효과적으로 재생하는 좋은 접근법을 제시하고 있다. 그러나 이러한 손상의 완전한 재생을 달성하는 것은 여전히 연구자들에게 중요한 도전이 된다. 조직 공학 분야가 발전함에 따라, 세포 환경에 대한 철저한 이해가 재생 기법을 더욱 완벽하게 만드는 데 필수적임이 분명해졌다. 세포 기반 조직과 기관을 더 정확하게 모방하기 위해, 연구자들은 모든 필요한 요소를 이해하려고 노력하고 그들이 고안한 시스템의 효과성을 향상시키기 위해 수많은 시도를 해왔다. 조직 공학에서 고려해야할 여러 가지 사항 중에서 3 차원 (3D) 환경을 구축하는 것이 가장 중요하면서도 기본적인 요구사항으로 남아 있다. 이는 조직에서 세포가 그들의 3 차원 환경으로부터 다양한 신호를 받기 때문이다. 이는 성장 인자, 사이토카인, 매트릭스 단백질로부터의 생화학적 신호나 생체역학적 자극일 수 있다. 생체역학적 자극은 인장, 압축, 흐름 유도 전단 응력과 같은 활성 기계적 힘과 미세 환경의 물리적 특성을 포함하여 넓게 해석될 수 있다. 생화학적 환경과 기계적 환경 모두 세포 행동을 조절하는 데 중요하며, 그들의 효과는 종종 복잡하게 얽혀 있다. 이러한 환경은 성장, 분화, 매트릭스 생산과 같은 세포 기능에 대해 통합으로 영향을 미친다. 생화학적 신호와 기계적 힘 사이의 상호 작용은 세포가 그들의 주변에 적절하게 반응하도록 보장하며, 조직의 동질성을 유지하고 재생 과정을 촉진한다. 점점 더 많은 연구들이 이러한 상호 작용에 초점을 맞추어 3D 환경에서의 세포 행동을 모델링하고 있으며, 이러한 교차 작용을 이해하는 것은 조직 공학을 발전시키고 자연 조직 동력을 효과적으로 모방하는 치료법을 개발하는 데 필수적이다.

본 논문에서는 3D 환경에서 세포가 어떻게 반응하는지에 대한 보다 정확한 이해를 가능하게 하는 3D 세포 배양 시스템 플랫폼 개발에 초점을 맞춘다. 이를 통해 기저 메커니즘을 밝혀내고 조직 공학 분야를 발전시키려고 한다. 우리의 접근 방식은 두 가지 주요구성 요소를 활용한다: 크기, 모양, 구조에 대한 정확한 제어를 제공하면서 비용과 시간 효율적인 3D 프린트된 폴리카프로락톤 스캐폴드, 그리고 알지네이트 기반 하이드로겔. 이를 통해 우리는 화학적 및 물리적 신호가 세포 행동에 미치는 각각의 효과를 조사할 수 있다. 이 연구는 치료 효과와 잠재적 메커니즘을 탐색하기 위해 세 가지 다른 모드를 중심으로 구성되어 있다. 첫 번째 모델은 화학적 신호와 물리적 신호를 결합하여 생화학적 신호의 치료적 영향에 초점을 맞춘다. 두 번째 방식은 화학적 신호 프레임워크에 물리적 신호를 통합하여 생화학적 신호와 생체역학적 자극의 시너지 효과를 강조한다. 세 번째 시나리오는 물리적 신호만을 검토하여 생체역학적 자극이 기계적 신호 활성화에 미치는 영향과 그 후속 효과를 강조한다. 이 다면적 접근법은 3D 환경에서 화학적 및 물리적 요인간의 복잡한 상호 작용에 대한 이해를 깊게 하여 결국 더 효과적인 조직 공학 전략에 기여하는 것을 목표로 한다.

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