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ABSTRACT 5

국문 초록 9

Contents 13

Chapter Ⅱ. Polyphasic taxonomic study of novel high-level taxon bacteria in phylum Bacteroidota and their polysaccharide degradation 24

1.1. Polysaccharides 24

1.2. Marine polysaccharides 25

1.3. Marine polysaccharide degradation 26

1.4. Bacteria phylum Bacteroidota 27

1.5. Polyphasic taxonomy study 31

1.5.1. Genotypic methods 31

1.5.2. Phenotypic methods 33

Chapter Ⅱ. Fulvivirga ulvae sp. nov., Fulvivirga ligni sp. nov., Fulvivirga maritima sp. nov., rich sources of carbohydrate-active enzyme for alginate, chitin, laminarin, starch, and xylan degradation 35

2.1. Introduction 35

2.2. Materials and Methods 36

2.2.1. Sampling and bacterial isolation 36

2.2.2. 16S rRNA-based phylogenetic analysis 37

2.2.3. Physiological characterization 38

2.2.4. Biochemical characterization 39

2.2.5. Chemotaxonomic characterization 40

2.2.6. Genome analysis 41

2.2.7. Polysaccharide-degrading enzyme activity assay 42

2.3. Results and Discussion 43

2.3.1. Isolation and identification 43

2.3.2. Physiological characteristics 44

2.3.3. Biochemical characteristics 45

2.3.4. Chemotaxonomic analysis 46

2.3.5. Genome analysis 47

2.3.6. Annotated function analysis 48

2.3.7. Polysaccharide-degrading enzyme activity 51

2.3.8. Taxonomic conclusion 52

Chapter Ⅲ. Zosteribacter laminarini gen. nov., sp. nov., laminarin-oligosaccharide producer, class Cytophagia, phylum Bacteroidota 83

3.1. Introduction 83

3.2. Materials and Methods 86

3.2.1. Sampling and bacterial isolation 86

3.2.2. 16S rRNA-based phylogenetic analysis 86

3.2.3. Physiological characterization 87

3.2.4. Biochemical characterization 88

3.2.5. Chemotaxonomic characterization 89

3.2.6. Genome analysis 91

3.2.7. Polysaccharide-degrading enzyme activity assay 93

3.2.8. Laminarin degradation in SG7u.111ᵀ and SG7u.132 93

3.2.9. Hydrolytic product analysis 94

3.3. Results and Discussion 95

3.3.1. Isolation and identification 95

3.3.2. Phylogenetic analysis 96

3.3.3. Physiological characteristics 97

3.3.4. Chemotaxonomic analysis 98

3.3.5. Polysaccharide-degrading enzyme activity 99

3.3.6. Laminarin-degrading hydrolytic product pattern 100

3.3.7. Genome analysis 102

3.3.8. Taxonomic conclusion 104

Chapter Ⅳ. Halocynthiibacter laminarini gen. nov., sp. nov., and Halocynthiibacter xylanolyticus sp. nov., first report for xylan and laminarin degradation of marine Bacteroidia bacteria, phylum Bacteroidota 136

4.1. Introduction 136

4.2. Materials and Methods 139

4.2.1. Sampling and bacterial isolation 139

4.2.2. 16S rRNA-based phylogenetic analysis 139

4.2.3. Physiological characterization 140

4.2.4. Biochemical characterization 141

4.2.5. Anaerobic metabolic characterization 142

4.2.6. Chemotaxonomic characterization 143

4.2.7. Genome analysis 144

4.2.8. Polysaccharide-degrading enzyme activity assay 147

4.2.9. Growth of DS1-an-13321ᵀ and DS1-an-2312ᵀ on laminarin and xylan 147

4.2.10. The location of laminarin and xylan-degrading enzymes on DS1- an-13321ᵀ and DS1-an-2312ᵀ 148

4.2.11. Hydrolytic product analysis 148

4.3. Results and Discussion 150

4.3.1. Isolation and identification 150

4.3.2. Physiological characterization 151

4.3.3. Phylogenetic analysis 151

4.3.4. Chemotaxonomic characterization 153

4.3.5. Anaerobic metabolism 154

4.3.6. Polysaccharide utilization 155

4.3.7. Growth of DS1-an-13321ᵀ and DS1-an-2312ᵀ on laminarin and xylan 156

4.3.8. Hydrolytic product pattern 156

4.3.9. Genomic analysis 157

4.3.10. Polysaccharide degradation capability from genomic approach 158

4.3.11. Xylan utilization mechanism 160

4.3.12. Taxonomic conclusion 163

Chapter Ⅴ. Discussion and conclusions 188

References 196

Table Ⅱ-1. Comparative physiological characteristics of three novel strains SS9-... 59

Table Ⅱ-2. 16S rRNA gene sequence similarity among novel strains: 1, SS9-22ᵀ..., 61

Table Ⅱ-3. Differential biochemical characteristics of novel strains SS9-22ᵀ... 62

Table Ⅱ-4. Composition of the cellular fatty acid of three novel strains SS9-... 67

Table Ⅱ-5. Comparative genome properties of three novel strains with existing... 69

Table Ⅱ-6. ANI values and digital DNA-DNA hybridization values among novel... 71

Table Ⅱ-7. Distribution of CAZyme in the genome of species in genus Fulvivirga... 72

Table Ⅱ-8. Polysaccharide-degrading genes and in vitro activities of strains SS9-... 74

Table Ⅱ-9. CAZyme components encoded in genomes of three novel strains SW1-... 76

Table Ⅲ-1. Comparative physiological characteristics of two novel strains... 114

Table Ⅲ-2. 16S rRNA gene sequence similarity among two novel strains: 1,... 123

Table Ⅲ-3. ANI, digital DNA-DNA hybridization, AAI, and POCP values... 124

Table Ⅲ-4. Comparison of cellular fatty acid compositions of two novel... 126

Table Ⅲ-5. Growth on organic substrates of strains SG7u.111ᵀ and SG7u.132... 130

Table Ⅲ-6. Genome properties of two novel strains SG7u.111ᵀ and SG7u.132 and... 132

Table Ⅲ-7. Distribution of glycoside hydrolase (GH) and CAZyme-active... 133

Table Ⅲ-8. Matching the manual constructed gene clusters with CGC obtained... 135

Table Ⅳ-1. Comparative physiological characteristics of two novel strains DS1-... 175

Table Ⅳ-2. 16S rRNA gene sequence similarity among novel strains: 1, DS1-an-... 177

Table Ⅳ-3. ANI, digital DNA-DNA hybridization, AAI, POCP values calculated... 178

Table Ⅳ-4. Comparison of cellular fatty acid compositions of two novel... 179

Table Ⅳ-5. Growth on organic substrates of strains DS1-an-13321ᵀ and DS1-an-... 182

Table Ⅳ-6. Summary the genome features of DS1-an-13321ᵀ and DS1-an-2312ᵀ 183

Table Ⅳ-7. Comparison of CAZyme features between strains DS1-an-13321ᵀ and... 184

Table Ⅳ-8. Predicted genes related to laminarin degradation and main chain of... 185

Table Ⅳ-9. Putative gene annotation and BLAST analysis of gene components in... 186

다당류는 해양 유기물의 탄소 인벤토리에서 상당 부분(>830 PgC)을 차지하고 대형 및 미세 조류에서 주요 구조적 요소들을 형성하는데 필요하다. 해양 생태계에서 대부분의 다당류는 종속 영양 박테리아의 활동에 의해 빠르게 CO2로 전환되는데, 그 중Bacteroidota 는 Bacteroidetes 그룹을 비롯하여 해양 박테리아 중 가장 풍부하게 존재하는 그룹 중 하나로, 다당류 분해자로 널리 알려져 있다. Bacteroidota 는 다당류를 효율적으로 분해되는 독특한 장치를 가지고 있는데, 이 장치는 carbohydrate-active enzymes (CAZymes), SusD, SusC, 세포질-막 결합 수송체 및 조절자로 구성되며, 각각 다당류를 올리고 및 단당류로 분해, 다당류 포획, 올리고당과 단당류의 세포주변질 및 세포질로 운반함으로써 장치의 작동을 조절한다. 또한, 위 구성 요소들은 박테리아 유전체상의 polysaccharide utilization loci (PUL) 로 알려진 영역에 공통적으로 암호화되어 있다는 특징이 있다. 해양에서 일어나는 대규모의 다당류 분해를 조사하기 위한 많은 메타게노믹스, 전사체 및 메타단백질등의 연구들이 있었으나, 현재까지는 미생물 군집과 효소들이 해양 다당류 분해에 기여하는 잠재적인 역할에 대한 예측으로만 남아 있다. 따라서 1장에서는 Bacteroidota 박테리아에 의한 다당류 분해 연구의 현황에 대해 이야기하고, 실질적으로 해양에서 발생하는 다당류 분해에 대한 이해를 넓히기 위한 필수적인 자원으로서 박테리아 분리주, 특히 Cytophagia 및 Bacteroidia 그룹에 대한 역할을 강조하였다. 본 연구에서는 해양에서 새롭게 분리된Bacteroidota 문의 박테리아에 대안적인 방법을 적용하여 분류법과 당 대사 및 다당류 분해 능력에 대한 연구를 진행하였다.

2장에서는 서해와 동해에서 채취한 해조류와 부패한 목재에서 SS9-22T, W9P-11T, SW1-E11T로 명명된 3개의 새로운 호기성 박테리아의 분리에 대한 연구를 다루었다. 다상 분류학 연구를 통해 3개의 분리주가 Fulvivirga 속, Cytophagia 강에 속하는 3개의 새로운 종으로 확인되었으며, 분류 및 특성화되었다. 게놈 마이닝을 통해 최대 90개의 CAZyme과와 60-70개의 PUL 유사 클러스터를 포함하는 수백 개의 CAZyme을 보유하고 있는 것이 밝혀졌으며, 이는 Fulvivirga 속의 다른 종에 존재하는 유전자 수를 초과한 것으로 밝혀졌다. In vitro 실험을 통해 알지네이트, 키틴, 라미나린, 전분 및 자일란을 이용할 수 있음을 확인하였으며, 이는 3개의 새로운 Fulvivirga spp.가 생명공학분야에서 활용될 수 있는 다당류 분해 활성 CAZymes의 풍부한 공급원임을 강조한다. 결과적으로, 3개의 새로운 종은 명명법에 의해, 균주 SS9- 22T는 Fulvivirga ulvae, W9P-11T는 Fulvivirga ligni, SW1-E11T는 Fulvivirga maritima로 명명하였다.

3장에서는 대한민국 동해에서 수집한 부유식 해초에서 SG7u.111T 및 SG7u.132로 명명된 두 개의 호기성 분리주가 분리에 대한 연구를 다루었다. 다상 분류학 연구를 통해 두 개의 새로운 분리주가 식별, 분류, 특성화 및 제안되었으며, 이는 Flammeovirgaceae 과, Cytophagia 강 계통의 새로운 종으로 확인되었다. In vitro 실험으로부터 두 개의 새로운 분리주가 단당 및 이당류를 잘 활용하고 한천, 알지네이트, 키틴, 라미나린, 전분 및 자일란의 여러 다당류를 분해할 수 있음을 확인하였다. 게놈 마이닝은을 통해 최대 380개의 CAZymes, 121개의 PUL 유사 클러스터를 보유하고 있으며, 이는 Flammeovirga 속의 잘 알려진 다당류 분해자와 유사하며 Flammeovirgaceae과 및 Persicobacteraceae 계통의 다른 구성체 수와 해양 Bacteroidota 구성체의 미디어 가치를 초과하는 것으로 나타났다. 두 새로운 분리주의 라미나린 분해에 대한 추가 연구를 통해 새로운 Cytophagia 박테리아의 전략이 해양 생태계의 탄소 순환과 질소 순환에 기여한다는 이해를 확장할 수 있었다. 본 연구에서는 라미나린 분해가 최종 생성물로서 포도당과 젠티오비오스를 생성한다는 것을 확인했으며, 이는 라미나린 degrading 효소가 exo- 및 endo-β-1,3-glucanase와 endo-β-1,6-glucanase를 포함한다는 것을 나타낸다. 그 결과, 우리는 Cytophagia 등급의 새로운 분리주에서 라미나린 분해에 대한 개략적인 모델을 예측하였으며, 결과적으로 두 개의 새로운 분리주는 명명법에 의해 Zosteribacter 라는 새로운 속으로 명명되었다. 11월, 새로운 종 SG7u.111T는 Zosteribacter laminarinilyticus로 명명되었으며 균주 SG7u.132는 해당 종에 속한다.

4장에서는 대한민국 동해에서 채취한 멍게에서 DS1-an-13321T 및 DS1- an-2312T로 명명된 두 개의 혐기성 분리주가 분리에 대한 연구를 다루었다. 다상 분류학적 연구를 통해 두 개의 새로운 분리주가 확인, 분류, 특성화 및 Prolixibacteraceae 과, Bacteroidia 강에 속하는 새로운 속으로 제안하였다. In vitro 실험에서 갈락토스, 포도당, 말토스, 락토스, 수크로스 및 전분에서 발효될 수 있는 것으로 나타났으며, 균주 DS1-an-2312T만이 자일로스에서 발효될 수 있으며, 주요 발효 산물로 아세트산과 프로피온산을 생산할 수 있음을 확인하였다. 두 균주 모두 라미나린을 분해할 수 있으며, 전분만 DS1-an-2312T가 자일란을 분해할 수 있었다. 게놈 마이닝을 통해 각각 57개와 65개의 CAZyme 계열과 27-34개의 PUL을 포함하는 155개와 159개의 CAZyme을 보유하고 있는 것으로 확인되었다. 두 새로운 분리주의 라미나린과 자일란 분해에 대한 추가 연구를 통해 Bacteroidia 계통의 새로운 혐기성 박테리아가 해양 생태계에서 탄소 순환에 기여한다는 전략을 이해할 수 있었다. 그 결과, 해당 균주들의 라미나린 분해 효소는 세포 관련 단백질이었고, 라미나린을 분해하여 최종 산물로 포도당을 생산했으며, 엑소 가수분해 효소 활성을 포함함을 확인하였다. 균주 DS1-an-2312T의 자일란 분해 효소는 세포 관련 단백질이었고, 자일란을 분해하여 주요 산물인 자일로트리오스와 자일로트라오스를 생산했으며, 내인성 가수분해 효소 활성을 포함함을 확인하였다. 자일로스의 활용과 자일란 분해에서 균주 DS1-an-2312T의 개략적인 모델 예측이 제안되었으며, 결과적으로 두 개의 새로운 분리주가 명명법에 의해 Halocynthiibacter gen. nov. 유전자로 제안되었다. 균주 DS1-an-13321T는 Halocynthiibacter laminarini로 명명되었으며, 균주 DS1-an-2312T는 Halocynthiibacter xylanolyticus로 명명되다.