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Title Page 2

Abstract 5

Contents 7

Abbreviation 9

Introduction 10

Materials and Methods 17

1. Co-transfection of Heavy and Light Chain Expression Vectors in ExpiCHO Cells for Antibody Production 17

2. Antibody Purification 17

3. SDS-PAGE for Antibody Purity Analysis 18

4. HPLC Analysis for Antibody Purity 18

5. Thermal Shift Assay 18

6. Western Blot Analysis of Antibody Stability During 24-Hour In vitro Permeability Assay 18

7. Indirect ELISA-Based Comparison of Antibody Binding Affinity 19

8. In vitro Blood-Brain Barrier (BBB) Permeability Assay 19

9. Dextran Permeability Assay 20

10. Immunocytochemistry for Tight Junction Proteins 20

11. Quantification of Transwell-Permeated Antibodies by Indirect ELISA 21

12. Biolayer Interferometry (BLI) for Binding Affinity 21

13. Statistical analysis 21

Results 22

1. Design and Production of Antibody fused with Peptide at the Heavy Chain (HC-BPP/LC) 22

2. In vitro Characterization of HC-peptide/LC Antibody 22

3. Establishment and validation of the in vitro BBB model 23

4. In vitro Blood-Brain Barrier (BBB) Permeability Assessment of HC-peptide/LC Antibody 24

5. Design and Production of Antibody fusion constructs with Peptide at Both Heavy and Light Chains (HC-BPP/LC-BPP) 25

6. In vitro Characterization of HC-BPP/LC-BPP(BPP(4)) Antibody 25

7. In vitro BBB Permeability Test of HC-peptide/LC-peptide Antibody 26

Figures 27

Tables 42

Discussion 45

Reference 50

국문 요약 55

List of Tables 8

Table 1. Brain-Penetrating Peptides (BPPs) Used in This Study 42

Table 2. Expression yield, purity, and thermal stability (Tm) of antibody-peptide fusion... 43

Table 3. Summary of binding kinetics for antibodies-peptide fusion 44

List of Figures 8

Figure 1. Schematic representation of dual BPP-fused antibodies and the construction of DNA... 27

Figure 2. Purity assessment of peptide-fused antibodies (HC-BPP/LC) by SDS-PAGE & SEC-... 29

Figure 3 Thermal Stability Profiles of Antibodies Assessed by Thermal Shift Assay (HC-BPP/LC) 30

Figure 4. Comparison of antigen binding between the parental antibody and HC-BPP/LC... 31

Figure 5. Differentiation scheme of human iPSCs into brain microvascular endothelial-like cells... 32

Figure 6. Validation of in vitro BBB model integrity using immunocytochemistry and Dextran... 33

Figure 7. Permeability assessment of HC-BPP/LC antibodies in the in vitro BBB model 34

Figure 8. Schematic representation of antibodies fused with four BPPs and the construction of DNA... 35

Figure 9. Purity assessment of purified HC-BPP/LC-BPP antibodies by SDS-PAGE & SEC-HPLC 36

Figure 10. Thermal Stability Profiles of Antibodies Assessed by Thermal Shift Assay (HC-... 37

Figure 11. Comparative analysis of binding affinity between BPP(2) and BPP(4) 38

Figure 12. Evaluation of the permeability and stability of HC-BPP/LC-BPP antibodies in the in... 40

초록보기

 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 아밀로이드 베타(Aβ) 플라크, 타우 응집체, 인지 기능 저하와 같은 병리학적 특징을 가지는 진행성 신경퇴행성 질환이다. ApoE4 대립유전자를 보유한 개인은 AD 발병 위험이 유의하게 종가하는 것으로 알려져 있다. 현재 AB, 타우, 또는 ApoE4를 타겟으로 하는 여러 단일클론항체 기반 면역 치료제가 개발되고 있지만, 혈액-뇌 장벽(BBB)의 제한적인 특성으로 인해 전신 투여된 항체 중 약 0.1%만이 뇌에 도달하는 것으로 알려져 있다. 또한, Aβ를 타겟으로 하는 항체는 ARIA(amyloid related imaging abnormalities)와 같은 이상 반응을 유발할 수 있으며, 이러한 부작용은 BBB 투과성을 개선함으로써 완화될 수 있다고 보고되였다. 이러한 문제들은 뇌로의 치료제 전달 효율을 높일 수 있는 전략 개발의 시급함을 부각시킨다.

본 연구에서는 BBB에서 발현되는 수용체에 특이적으로 결합하는 8 종의 수용체 매개 트랜스사이토시스(RMT) 기반 펩타이드를 선정하여, 이를 단일클론 모체 항체의 C-말단에 유전적으로 융합시켰다. 펩타이드는 (GGGGS), 유연성 링커를 사용해 무거운 사슬(heavy chain)에 결합되었다. 우리는 SDS PAGE, ELISA, 차등주사 형광계(DSF), 바이오레이어 인터페로메트리(BLI)를 사용하여 펩타이드 접합이 항체의 안정성 및 항원 결합에 미치는 영향을 평가했다. 또한, hPSC(IMR90)로부터 분화시킨 인간 뇌내피세포(hBEC)를 이용해 생체 외 모델을 확립하고, 각 접합체의 명목적 투과계수(Papp)를 측정했다.

선정된 펩타이드를 경량 사슬(light chain)에 접합하여 결합 모드의 변화가 BBB 투과성에 미치는 영향을 평가했다. 주요 후보에 대해서는 BLI를 통한 기능적 특성화가 수행되었다.

그 결과, APEP2, RVG29, THR, APEP7은 생체 외 모델에서 모항체에 비해 높은 투과율로 유망한 펩타이드로 확인되었다. 반면, L57과 LRPep2는 SDS PAGE 및 HPLC 결과에서 안정성 감소를 보였다. APEP2, RVG29, THR, APEP7 은 모체 항체에 비해 향상된 BBB 투과성을 나타냈지만, THR을 제외 하고는 걸합 모드의 차이에 따른 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 결론적으로 이러한 항체 펩타이드 접합 약물체가 모항체에 비해 투과율이 상승된다는 점을 확인했다. 그 투과율의 차이가 크지가 않고, 생체 내에서의 결과를 확인하지 못했기에 실제적으로 개발되기에 여러 한계졈이 존재한다. 하지만 이러한 연구를 기반으로 항체 펩타이드 접합을 통한 성공적인 혈액-뇌 장벽 투과율 개션 의약품 개발에 다가가는 것에 기여한 겻에 의의가 있다고 생각한다.

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