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Title Page 2

Contents 5

List of Abbreviations 8

Abstract 9

1. Introduction 11

2. Materials and Methods 16

2.1. Cells 16

2.2. Gene Synthesis and Plasmid Cloning 16

2.3. Construction and Production of GrAb 18

2.4. In Vitro Transcription of mRNA 19

2.5. Preparation of mRNA-LNP 20

2.6. RiboGreen assay 22

2.7. Formation of GrAb-LNP 23

2.8. SDS-PAGE analysis 23

2.9. Ultracentrifugation 23

2.10. Dynamic light scattering (DLS) 24

2.11. Luciferase assay 24

2.11.1. Luciferase assay for In Vitro Cellular Uptake Assay 24

2.11.2. Luciferase Assay for In Vitro miRNA-Dependent Regulation 25

2.12. Fluorescence activated cell sorting (FACS) 26

2.13. Western Blot 26

2.14. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) 28

2.15. In Vitro Cell Growth Inhibition Assay 29

2.16. Apoptosis assay 29

3. Results 31

3.1. Construction and Characterization of Panitumumab-GrAb and EGFRLNP 31

3.2. In vitro analysis of EGFR expression and receptor-mediated binding of EGFRLNPs 35

3.3. In vitro evaluation of EGFRLNP-mediated functional mRNA delivery 39

3.4. In vitro analysis of mRNA repression by miR-122-responsive 3′UTRs 42

3.5. p53 mRNA Delivery via Engineered 3′UTR and EGFRLNPs 46

3.6. Evaluation of the synergistic anticancer effect of p53 and SMAC mRNA co-delivery via LNPs 50

4. Discussion 56

References 59

Summary (Korean) 62

List of Tables 7

Table 1. Strains 17

Table 2. Engineered miR-122-responsive 3′UTR sequences 18

Table 3. Composition of lipid mixture composition for Lipid nanoparticle (LNP) 20

Table 4. Primer sequences used for qRT-PCR 29

List of Figures 7

Figure 1. Design, characterization, and assembly of EGFR-targeted mRNA-... 34

Figure 2. EGFR-dependent binding of EGFRLNPs in various cancer cell lines 38

Figure 3. Evaluation of functional mRNA delivery by EGFRLNPs in EGFR-... 41

Figure 4. In vitro assessment of miR-122-responsive 3′ UTRs for... 45

Figure 5. p53 mRNA Delivery via Engineered 3′UTR and EGFRLNPs 49

Figure 6. Synergistic effect of p53 and SMAC mRNA in p53-null cancer cells 55

초록보기

 메신저 RNA(mRNA) 기반 치료제는 신속한 개발, 대규모 생산의 용이성, 다양한 치료 단백질 인코딩이 가능하다는 유연성을 바탕으로 암 치료 분야에서 유망한 전략으로 주목받고 있다. 특히, mRNA 의 전달체로 지젤 나노입자(Lipid Nanoparticles, LNPs)가 주요 플랫폼으로 활용되고 있다. 그러나 오프타깃 효과(off-target effect)와 간에서의 비특이적 축적에 따른 비의도적 유전자 발현 및 독성은 여전히 mRNA-LNP 치료의 주요 한계로 작용한다. 이를 극복하기 위해, 본 연구에서는 수용체 매개 표적화, 마이크로 RNA(miRNA) 반응성 번역 조절, 병용 유전자 치료 전략을 통합한 종양 특이적 mRNA 전달 플뱃폼을 개발하였다. EGFR 을 발현하는 암세포에 선택적으로 mRNA 를 전달하기 위해, EGFR 특이적 항체인 파니투무맙(Panitumumab)과 아포지단백 A1(Apolipoprotein A1, ApoA1)을 융합한 단백질(그랩항체)을 설계하였으며, 이는 별도의 화학적 접합없이 LNP 표면에 자가조립되어 EGFR 표적 LNP(EGFRLNP)를 형성하였다. 본 플랫폼은 우수한 표적 결합 특이성과 전달 효율을 나타냈다. 또한, 간세포에서 높게 발현되는 miR-122의 결합 서열을 mRNA의 3' 비번역 영역(3'UTR)에 삽입하여 간 특이적 오프타깃 발현을 효과적으로 억제하였다. 그 결과, 간 유래 세포에서는 mRNA 번역이 80% 이상 감소하였고, miR-122 발현이 낮은 종양세포에서는 안정적인 단백질 발현이 유지되었다. 치료 유전자로는 종양 억제 유전자 p53과 세포사멀 유도 단백질 SMAC의 mRNA를 병용하였으며, 이 조합은 p53 결실 암세포에서 농도 의존적으로 세포 생존율을 감소시키고, 단독 처리 대비 유의한 세포사멸 증가를 유도하여 시너지 효과를 보였다. 결론적으로, 본 연구는 EGFR 기반 표적화, miRNA 기반 발현 조절, 유전자 병용 전략을 통합함으로써 종양 특이적 mRNA 전달과 향상된 항암 효능을 동시에 실현할 수 있는 정밀 치료 전략의 가능성을 제시한다.

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