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Title Page 2

Contents 5

List of Abbreviations 9

Abstract 11

1. Introduction 13

2. Materials and Methods 18

2.1. Materials 18

2.2. Animals 19

2.3. Animal experiment design 19

2.4. Pg-hWE (Pomegranate hot water extract) preparation 19

2.5. Mouse serum ELISA 20

2.6. Histological analysis 20

2.7. Mouse tissue quantitative real-time PCR analysis 21

2.8. Whole lysate preparation and immunoblotting analysis 22

2.9. ABTS assay 23

2.10. DPPH assay 24

2.11. Cell culture 24

2.12. Cell viability assay 25

2.13. CHO-K1 cell line quantitative real-time PCR analysis 25

2.14. Luciferase Reporter gene assay 27

2.15. ROS (Reactive oxygen species) generation assay 27

2.16. Annexin V/PI flow cytometry 28

2.17. Statistical analysis 28

3. Results 30

3.1. Pg-hWE alleviates the symptoms of polycystic ovarian syndrome 30

3.2. Pg-hWE regulates apoptosis factors, NF-κB elements, and antioxidant factors in uterus at protein levels 37

3.3. Pg-hWE alleviates PCOS by regulating androgen synthesis pathway-related genes and inflammatory cytokines and by regulating apoptosis factors and antioxidant factors at the protein level in ovaries 42

3.4. Pg-hWE reduces apoptosis (cell death) in CHO-K1 cell line 47

3.5. Pg-hWE has antioxidant effects on CHO-K1 cell line 51

4. Conclusion and Discussion 58

References 62

논문요약 66

List of Tables 7

Table 1. Primer sequences used for mouse tissue quantitative real-time PCR 22

Table 2. Primer sequences used for CHO-K1 cell quantitative real-time PCR 26

List of Figures 8

Figure 1. Pg-hWE alleviates PCOS symptoms in mouse model checked by... 36

Figure 2. Pg-hWE regulates apoptosis factors, NF-κB elements, and... 41

Figure 3. Gene and protein expression level in PCOS mouse model ovaries 46

Figure 4. Flow cytometry of apoptosis in CHO-K1 cell line 50

Figure 5. Antioxidative effects of Pg-hWE on CHO-K1 cell line 57

Figure 6. Graphical scheme of Pg-hWE for PCOS 61

초록보기

 인간의 기대 수명이 증가함에 따라 건강, 특히 여성 건강에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이는 전반적인 삶의 질은 물론 생식 기능과도 밀접하게 관련되어 있다. 다낭성 난소 증후군(PCOS)은 전 세계 가임기 여성의 약 10%에 영향을 미치며, 비만과 인슐린 저항성과 같은 대사 질환과 관련이 있다. 그럼에도 불구하고 PCOS의 병태생리는 충분히 규명되지 않았으며, 이에 따라 신뢰할 수 있는 연구와 적절한 동물 모델의 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 DHEA (30 mg/kg)를 피하 주사하여 마우스에 PCOS를 유도하였고, 경구 투여한 석류 추출물 Pg-hWE (100 mg/kg)의 치료 효과를 평가하였다. H&E 염색을 통한 조직학적 분석 결과, Pg-hWE 처리군에서 황체의 수가 회복되고 위축된 난포(atretic follicle)의 수가 감소함으로써 배란 기능이 개선되고 난포 퇴행이 억제됨을 확인할 수 있었다. 자궁조직의 단백질 수준 분석에서는 Pg-hWE 처리 시 BAX, cleaved caspase-3 및 cleaved caspase-9 등의 세포사멸 관련 지표가 감소했다. 난소 조직의 mRNA 분석에서도 BAX, IL-6, TNF-α 및 IFN-γ 같은 염증 및 세포사멸 인자가 억제되고, 항세포사멸 인자인 Bcl-2가 증가하는 효과가 나타났다. 또한, 안드로겐 생합성에 관여하는 CYP11A1 과 CYP17A1 유전자의 발현도 조절되어, 호르몬 조절 측면에서도 긍정적인 효과가 있음을 보여주었다. 이러한 생체 내 결과를 분자적 수준에서 뒷받침하기 위해 중국 햄스터 난소 유래 세포주인 CHO-K1을 이용한 세포 실험을 수행했다. Annexin V/PI 염색을 활용한 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 Pg-hWE가 세포사멸을 억제하고 항산화 능력을 갖는다는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 Pg-hWE의 치료 가능성을 뒷받침하지만, 그 정확한 작용 기전은 아직 명확하지 않으며, 생체 내외 실험 간의 간극을 좁히기 위한 추가적인 메커니즘 연구가 필요해 보인다. 이는 향후 PCOS 치료 전략 개발에 중요한 단서를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

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