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Title Page 2

Contents 5

List of Abbreviations 8

Abstract 13

Chapter 1. Introduction 15

1. Cytological roles and modulation of mTOR/S6K1 signaling pathway 15

2. mTOR/S6K1 signaling pathway in tissue development and differentiation 17

3. Pancreatic β cell development and stem cell derived β cells 19

4. Human brain development and neuronal differentiation from pluripotent stem cells 20

5. The role of multicellular organization in directing cell fate and differentiation 22

6. Aim of this thesis 25

Chapter 2. Materials and methods 27

1. Materials 27

1.1. Antibodies 27

1.2. Plasmid constructs 28

1.3. Reagents 29

2. Methods 31

2.1. Cell culture 31

2.2. Plasmid construction 32

2.3. Generation of S6K1 depleted human embryo cell line and missense mutated mTOR human embryo cell line 33

2.4. Generation of S6K1 knockdown DLD1 cell lines 34

2.5. Stem cell derived pancreaticβ cell differentiation 34

2.6. Immunoblot analysis 37

2.7. RT-qPCR analysis 37

2.8. Genomic DNA PCR 38

2.9. Whole mount staining 38

2.10. Single cell RNA sequencing 39

2.11. Brain organoid differentiation 40

2.12. Cryo-sectioning and immunofluorescence staining of organoids 41

2.13. Generation of DLD1 3D spheroids and induction of bud formation 42

2.14. Statistical analysis 43

Chapter 3. Result 46

1. Abnormal Differentiation of Stem Cell Derived β Cells with S6K1 Depleted Human Embryo Stem Cells 46

2. Decrease Cycling and ECM Rich cells in S6K1⁻ᐟ⁻ Spheroids during Pancreatic Development 58

3. Alterations in cytoskeleton and cell junction proteins and disruption of protein compartmentalization in the 3D cellular structure of S6K1⁻ᐟ⁻ spheroids 64

4. Gene Expression Patterns and Phenotypes Related to Bud Formation are Recapitulated in DLD1 3D Spheroids 69

5. Differences in the expression of genes related to cellular architecture and tissue morphogenesis in DLD1 3D spheroids according to changes in S6K1 expression 75

6. The population reduced in the pancreatic spheroids derived from the S6K1⁻ᐟ⁻ line plays a role in secreting ligands important for endocrine development 81

7. Analysis of the relationship between mTOR hyperactivation, multicellular structure, and neuronal development through Smith-Kingsmore syndrome modeling using brain organoids 88

Chapter 4. Discussion 98

Chapter 5. References 102

논문요약 115

List of Tables 10

Chapter 1. Introduction 10

Table 1. Summary of mTOR signaling in stem and progenitor cells 18

Chapter 2. Materials and methods 10

Table 1. Differentiation schedule of stem cell derived pancreatic β cell 35

Table 2. Sequence for oligos used in genome editing 44

Table 3. Sequence for primers used in RT-qPCR 44

List of Figures 11

Chapter 1. Introduction 11

Figure 1. Diverse cause and effect of mTOR signaling pathway 16

Figure 2. Schematic Summary of generating stem cell derived β cells 20

Figure 3. Summary of generating brain organoid, and the layers and cell types... 22

Figure 4. Stiffness-based differentiation of stem cells 24

Chapter 3. Result 11

Figure 1. Generation of S6K1-depleted human embryo stem cells (hESCs)... 48

Figure 2. Sequential differentiation patterns during stem cell derived β cell... 51

Figure 3. Structural dysregulation of 3D spheroids during pancreatic progenitor... 53

Figure 4. Abnormal development of endocrine cells from S6K1⁻ᐟ⁻ hESCs 56

Figure 5. Population analysis of WT and S6K1⁻ᐟ⁻ cells during pancreatic... 60

Figure 6. DEG analysis using pseudo-bulk analysis in the population with a... 63

Figure 7. Abnormal expression and distribution of CDH1 and VIM in S6K1⁻ᐟ⁻... 68

Figure 8. capitulation of bud formation and CDH1 expression according to S6K1... 74

Figure 9. Analysis of gene expression pattern changes in DLD1 3D spheroids... 77

Figure 10. Reduction of the population secreting ligands essential for endocrine... 85

Figure 11. Schematic summary of the effects of S6K1 on hESC-derived 3D... 87

Figure 12. Increased mTOR signaling pathway activity in hESCs with the... 90

Figure 13. Phenotype of dorsal forebrain organoids with the Smith Kingsmore... 93

Figure 14. Persistence of rosette structures and abnormal cell organization... 97

초록보기

 mTOR/S6K1 신호 전달 체계는 성장 호르몬, 아미노산, 당류 등 다양한 요인에 의해 영향을 받으며, 하위 조절 경로로 세포의 성장, 증식, 단백질 발현 및 생존에 영향을 미쳐, 세포의 기능 조절 유지에 매우 중요하다. mTOR/S6K1 신호 전달 체계가 붕괴되어 잘 조절되지 않았을 때, 뇌, 심장, 췌장 등 다양한 조직에서 발달 과정에 문제가 생긴다는 것이 쥐 실험에서 알려져 있었다. 또한, mTOR 신호 전달 체계의 잘못된 조절이 인간의 뇌 발달 과정에 영향을 미쳐 자폐 스펙트럼이나 인지 발달 장애를 일으킨 다는 점 역시 잘 알려져 있다.

mTOR/S6K1 신호 전달 체계의 연구는 대부분 암세포에서 많이 이루어져 왔으며, 이에 따라 세포의 증식, 단백질의 합성, 자가 포식과 관련된 하위 조절 인자들이 많이 밝혀져 왔다. 하지만, 실제 조직의 발달이나 분화 과정에서, mTOR/S6K1 신호 전달 체계가 어떤 하위 조절로 영향을 미치는 가에 대해서는 잘 연구되지 않았다. 본 연구에서는, 유전자 편집을 통해 S6K1 단백질이 결손된 인간 배아 줄기 세포로부터, 줄기 세포 유래 췌장 베타 세포를 분화시키는 프로토콜을 이용하여, S6K1 신호 전달 체계가 어떻게 분화에 영향을 미치는 가에 대해 밝혔다. S6K 1의 결손에 따라, 상피-중간엽 전환에 관여하는 전사 인자들의 발현이 억제되고, 이에 따라 세포 골격, 세포 간 연접의 전환이 정상적으로 이루어지지 않아, 3차원 세포 구조 형성의 결핍이 발생한다. 이는, 세포의 다양성 감소로 이어지고, 감소된 세포들이 췌장 내분비 세포 분화에 중요한 신호 전달 물질을 발현하는 것으로 밝혀냈다. mTOR 신호 전달 체계가 과활성화 되는 Smith-Kingsmore 증후군 유전자형의 인간 배아 줄기 세포로 유도한 뇌 오가노이드에서, 오가노이드 크기의 변화와 신경 로제트 주위 세포 배열의 이상을 확인할 수 있었다.

위와 같은 연구들을 통해, 본 연구에서는 mTOR/S6K1 신호 전달 체계가 3차원 분화 과정 상에서 다세포의 배열, 구조 변화 등을 통해 분화를 조절한다는 사실을 밝혔다.

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