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표제지 2

목차 7

1. 서론 12

2. 재료 및 방법 16

2.1. 나노물질과 시험 물질 준비 방법 16

2.2. ZnO NPs의 물리화학적 특성 분석 16

2.2.1. 구성 입자 크기 및 형태 분석 16

2.2.2. 수분산 입자 크기 및 표면 전하 측정 16

2.2.3. 결정 구조 분석 17

2.3. ZnO NPs의 정량 분석을 위한 표준곡선 작성 17

2.4. ICP-AES를 사용한 Zn 정량 분석 17

2.5. ZnO NPs의 용해도 분석 18

2.6. 세포주 및 배양 조건 18

2.7. 세포 성장 저해 실험(MTT assay) 18

2.8. 세포막 손상 확인 실험(LDH release assay) 19

2.9. 세포 내 활성산소종 정량 분석 실험(ROS generation assay) 20

2.10. 장관 세포 내 ZnO NPs의 유입양상 비교 20

2.11. In vitro 위장관 흡수 메커니즘 비교 21

2.12. 막 투과성 24

2.13. 실험동물 및 사육 조건 24

2.14. Everted small intestinal sac을 통한 intesrinal absorption 비교 24

2.14.1. Everted small intestinal sac model 구축 24

2.14.2. ZnO NPs의 intestinal absorption 비교 27

2.15. 통계 분석 27

3. 결과 28

3.1. ZnO NPs의 물리화학적 특성 분석 28

3.1.1. 구성 입자 크기 및 형태 분석 28

3.1.2. 수분산 입자 크기 및 표면 전하 측정 30

3.1.3. 결정 구조 분석 33

3.2. ZnO NPs의 정량 분석을 위한 표준곡선 작성 35

3.3. ZnO NPs의 용해도 분석 37

3.4. 세포 성장 저해 실험(MTT assay) 40

3.5. 세포막 손상 확인 실험(LDH release assay) 43

3.6. 세포 내 활성산소종 정량 분석 실험(ROS generation assay) 45

3.7. 장관 세포 내 ZnO NPs의 유입양상 비교 47

3.8. In vitro 위장관 흡수 메커니즘 비교 49

3.9. 막 투과성 51

3.10. ZnO NPs의 intestinal absorption 비교 54

4. 결론 56

5. 참고문헌 59

ABSTRACT 67

표목차 11

Table 1. Hydrodynamic diameters and zeta potentials of ZnO NPs in 1% different additive solvents 32

Table 2. Quantitative analysis of ZnO NPs 36

그림목차 9

Figure 1. The scheme for Caco-2 monolayer models and human FAE... 23

Figure 2. The scheme for ex vivo everted small intestinal sac models 26

Figure 3. Scanning electron microscopy (SEM) image and size... 29

Figure 4. Powdered X-ray diffraction (XRD) patterns of pristine ZnO... 34

Figure 5. Calibration curve for determination of ZnO NPs by ICP-AES... 36

Figure 6. Dissolution properties of ZnO NPs interacted with... 39

Figure 7. Effects of ZnO NPs interacted with methanol, glycerin, or... 41

Figure 8. Optical microscopic images of Caco-2 cells treated with ZnO NPs in minimum essential medium... 42

Figure 9. Effects of ZnO NPs interacted with methanol, glycerin, or... 44

Figure 10. Effects of ZnO NPs interacted with methanol, glycerin, or... 46

Figure 11. Cellular uptake of ZnO NPs when interacted with methanol,... 48

Figure 12. Intestinal transport of ZnO NPs when interacted with... 50

Figure 13. Permeability of Lucifer Yellow (LY) using in vitro... 53

Figure 14. Intestinal absorption of ZnO NPs when interacted with... 55

초록보기

 본 연구에서는 식품첨가물 ZnO NPs와 대표적인 첨가 용제(methanol, glycerin, propylene glycol)의 상호작용을 알아보기 위해서 용제와 상호작용한 ZnO NPs의 수분산 입자 크기, 표면 전하 및 결정성의 변화를 측정하여 물리화학적 특성을 분석하였다. DW와 세포 배양액 MEM의 조건에서 ZnO NPs의 용해도를 비교하였다. 또한, in vitro 인간 장 상피세포주인 Caco-2를 통해서 상호작용에 따른 세포 독성을 연구하였고 in vitro 위장관 흡수 메커니즘을 분석하고 ex vivo everted small intestinal sac model을 이용하여 흡수율 연구를 수행하여 용제와의 상호작용이 생물학적 반응에 미치는 영향을 조사하였다.

ZnO NPs는 수분상에서 응집하는 경향을 가져서 FE-SEM으로 측정한 pristine ZnO NPs의 평균 구성 입자 크기보다 DLS 방법으로 측정한 ZnO NPs의 수분산의 입자 크기가 더 크게 나타났다. 또한 용제와 상호작용한 ZnO NPs의 수분산의 입자 크기를 측정하여 비교한 결과, DDW보다 MEM에 분산하였을 때 더 작은 입자 크기를 나타냈고 30분 동안 분산하였을 때보다 24시간 분산하였을 때 더 작은 입자 크기가 측정되었다. 그리고 DDW와 MEM 조건 모두에서 glycerin과 propylene glycol와 상호작용한 경우에 수분산의 입자 크기가 감소하였다. 하지만 용제의 농도가 0.2%로 희석된 경우에는 유의적인 입자 크기의 차이가 나타나지 않아서 용제의 종류는 ZnO NPs의 수분산 입자 크기에 영향을 미치지만, 농도는 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. ELS 방법으로 측정한 ZnO NPs의 표면 전하는 DDW와 MEM 조건 모두에서 3가지 용제와의 상호작용으로 인해서 변하지 않았다.

또한, XRD 분석으로 측정한 ZnO NPs의 결정상은 3가지 용제의 상호작용에 의해서 변하지 않았고 ZnO NPs와 동일하게 wurtzite 구조를 가지는 것으로 확인되었다. DW와 MEM 조건에서 용제와의 상호작용이 ZnO NPs의 용해도에 미치는 영향을 상호작용 후 용해된 Zn의 정량분석을 통해서 비교하였다. DW와 MEM 조건 모두 glycerin과 propylene glycol에 분산한 경우가 ZnO NPs의 용해도를 더 증가시키는 것으로 나타났다. 약간이지만 증가한 용해도는 ZnO NPs 수분산 입자 크기 감소에 영향을 준 것으로 보인다. 하지만 DW와 MEM 조건 모두 전체 용해 수준은 1% 미만으로 낮은 용해도를 보였고 MEM은 FBS와 같은 다양한 생물학적 성분의 상호작용으로 인해 DW에 분산하였을 때보다 더 높은 ZnO NPs의 용해도를 보였다. 전반적으로 낮은 용해도로 인해서 ZnO NPs의 결정상 구조는 변하지 않은 것으로 보인다.

용제와의 상호작용에 따른 ZnO NPs의 세포 독성은 Caco-2 cell을 이용하여 평가하였다. Glycerin 및 propylene glycol과 상호작용한 ZnO NPs를 24시간 처리한 결과, methanol과 MEM에 분산시킨 경우보다 세포 성장 저해, 세포막 손상으로 인한 LDH 유출 및 ROS 유발로 인한 DCF가 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 상호작용을 통해서 ZnO NPs의 세포 독성이 더 높아진 것으로 판단되었다. 또한, 상호작용에 따른 ZnO NPs의 세포 내 유입 정도를 비교하였을 때 glycerin 및 propylene glycol에 분산하였을 때 더 높은 유입량을 보였다.

용제와 상호작용한 ZnO NPs의 위장관 흡수 메커니즘에 대해서 확인하기 위해서 Caco-2 monolayer 및 human FAE model를 구축하여 상호작용 후의 ZnO NPs의 수송양상을 비교하였다. 그 결과, Caco-2 monolayer model보다 human FAE model에서 더 높은 ZnO NPs의 수송량을 보였고 glycerin 및 propylene glycol에 분산하였을 때 더 높은 유입량을 보였다. 이는 상호작용으로 감소된 ZnO NPs의 입자 크기가 ZnO NPs의 장관내 수송에도 영향을 미친 것으로 생각된다. Lucifer Yellow를 이용한 막 투과성 측정으로 입자의 passive diffusion을 확인한 결과, 최고 투과도가 모든 경우에서 3% 미만이었으므로 용제와 ZnO NPs의 상호작용이 model 구축에는 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다. Glycerin 및 propylene glycol과 상호작용하였을 때 투과성이 증가하였다. 하지만 Lucifer Yellow으로 평가한 투과량은 ICP-AES를 이용한 수송량에 비해 낮았기 때문에 active 수송이 ZnO NPs의 주요 수송 경로임을 확인할 수 있다.

ZnO NPs와 용제의 상호작용이 생체 내 소장에서 ZnO NPs 흡수에 미치는 영향을 확인하기 위해서 ex vivo everted small intestinal sac을 구축하여 장내 흡수율을 비교하였다. Glycerin이나 propylene glycol에 분산하였을 때가 methanol과 Tyrode’s solution에 분산하였을 때보다 ZnO NPs의 장내 흡수율이 더 증가하였다

종합적으로, 식품 첨가 용제와의 상호작용으로 인해 ZnO NPs의 수분산 입자 크기 및 표면 전하와 용해도가 변화하였고, 그에 따라서 세포 내로 유입되는 양이 달라지면서 세포 성장 저해, 세포막 손상 및 ROS 유발과 같은 세포 독성에 영향을 미친 것으로 생각된다. 따라서 본 연구 결과는 식품첨가물 ZnO와 식품 첨가 용제의 상호작용이 물리화학적 특성과 세포 독성에 미치는 영향을 확인함으로써 ZnO NPs의 안전성에 대한 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.

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