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Title Page 2

ABSTRACT 5

Contents 6

1. Introduction 10

1.1. Influenza A vims 10

1.1.1. Structure and entry mechanism of influenza A virus 11

1.1.2. Limitations of current antiviral therapies 13

1.2. Host serine protease 14

1.3. Serine protease inhibitor 15

1.4. Somatomedin B domain-mediated stabilization of SerpinE1 18

1.5. Aim of this study 19

2. Methods and Materials 20

2.1. Construction of plasmids 20

2.1.1. Construction of 14-1B and VLHL 20

2.1.2. Construction of L3-WT, L4-WT 20

2.1.3. Construction of WT-L4 21

2.1.4. Construction of L4-WT-Fc, Fc-L4-WT 21

2.1.5. Construction of L4-WT-Fc(Mut), Fc(Mut)-L4-WT 21

2.2. Expression and purification of proteins 37

2.2.1. His-tagged proteins 38

2.2.2. Fc-tagged proteins 40

2.3. Characterization of SerpinE1 variants 41

2.3.1. Determination of the functional half-life 41

2.3.2. IC₅₀ values measurement 42

2.4. Size exclusion chromatography (SEC) 43

3. Results and Discussion 44

3.1. Development of a fusion strategy to improve the structural half-life of SerpinE1 using the SMB domain 44

3.2. Inhibitory activity of SMB-fused SerpinE1 47

3.3. Structural homogeneity of SMB-fused variants confirmed by SEC analysis 49

3.4. Functional half-life analysis of SMB-fused SerpinE1 52

3.4.1. Time-dependent increase in inhibitory activity of L4-WT during incubation at 37 °C 52

3.4.2. Comparative inhibitory activity of L4-WT versus wild-type and half-life extended SerpinE1 variants 55

3.4.3. Extended functional half-life of L4-WT under optimized conditions 57

3.5. Human IgG Fc fusion strategy for therapeutic application of SerpinE1 59

3.6. Inhibitory activity and structural assessment of Fc-fused SerpinE1 62

3.7. Extended half-life of Fc-fused SerpinE1 67

3.8. Mutation strategy for Fc domain silencing and functional evaluation of Fc-mutant fused SerpinE1 68

4. Conclusion 71

5. References 73

6. Abstracts in Korean 76

List of Tables 8

Table 1. Synthetic gene sequences used in this study. We've colored the Kozak... 31

Table 2. Amino acid sequences and protein size encoded by synthetic genes used... 35

Table 3. Primers used in this study 36

List of Figures 8

Figure 1. Schematic diagram of the influenza A virus structure and entry... 12

Figure 2. Role of SerpinE1 in influenza A virus activation. Created by the author... 17

Figure 3. Scheme of this study 19

Figure 4. Schematic of plasmid constructs used in this study. (a) Control variants... 46

Figure 5. Evaluation of the inhibitory activity of SMB-fused SerpinE1 against uPA.... 48

Figure 6. Structural analysis by SEC and SDS-PAGE. (a) Conformation analysis... 51

Figure 7. Functional stability of SerpinE1. (a) Functional half-life analysis of... 54

Figure 8. Comparative IC₅₀ analysis of wild-type and engineered SerpinE1 variants... 56

Figure 9. Comparison of functional half-life among SerpinE1 variants. Initial... 58

Figure 10. Engineered fusion constructs involving the SMB domain, IgG Fc region... 61

Figure 11. Structure and inhibitory activity analysis for Fc-fused L4-WT. (a) L4-... 65

Figure 12. Evaluation of the functional half-life of Fc-fused SerpinE1 67

Figure 13. (a) Engineered fusion constructs involving the SMB domain, IgG Fc... 70

초록보기

 인플루엔자 A 형 바이러스(Influenza A virus, IAV)는 높은 치사율로 인해 전세계적인 공중보건 문제로 부각되고 있다. 현재 사용되고 있는 항바이러스제들은 주로 바이러스의 복제 및 방출 과정을 표적으로 하여 감염 확산을 억제하지만, 메스꺼움 및 구토와 같은 위장관계 부작용이 흔히 동반되며, 특정 돌연변이를 보유한 내성 바이러스주의 출현으로 치료 효과가 저하될 수 있다. 이러한 한계는 바이러스 유전적 변이에 영향을 받지 않으며, 숙주 기반 기전을 활용하는 대체 치료 전략의 필요성을 시사한다.

IAV 는 숙주 세포 내 진입 시 hemagglutinin(HA)의 활성화가 필요하며, 이 과정에 숙주 유래 serine protease가 핵심적인 역할을 수행한다. 따라서 이러한 serine protease 를 억제하는 것은 유망한 치료 전략으로 간주된다. 본 연구에서는 숙주 유래 serine protease 억제제인 SerpinE1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)을 공학적으로 개량하여, 상기도 점막에서 바이러스의 침투를 효과적으로 차단할 수 있는 치료제를 개발하고자 하였다.

야생형 SerpinE1은 기능적 반감기가 짧아 임상적 활용에 제약이 있으므로, 본 연구에서는 천연 안정화 도메인과 인간 IgG 의 Fc 영역을 융합한 SerpinE1 변이체를 설계하였다. 설계된 융합 단백질은 37℃ 조건에서도 serine protease 를 효과적으로 억제하였으며, 2 시간 이내에 활성을 상실한 야생형과 달리 억제 활성을 안정적으로 유지하였다. 본 연구 결과는 공학적으로 개량된 SerpinE1 융합 단백질이 IAV 감염을 예방할 수 있는 새로운 항바이러스 치료 전략으로 활용될 수 있음을 시사한다.

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