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Title Page 1

Contents 4

Abbreviations 12

국문초록 14

ABSTRACT 16

Ⅰ. INTRODUCTION 19

1. Wound epidemiology and burden 19

2. The role of fibroblasts in wound healing 21

3. Cereblon, a multifunctional protein, has potential roles in wound healing 26

Ⅱ. OBJECTIVES 33

Ⅲ. MATERIALS AND METHODS 34

1. In vivo wound healing assay 34

2. Primary dermal fibroblast extraction and culture 35

3. Fluorescent immunocytochemistry staining 36

4. Flow cytometry 37

5. Cell proliferation assay 38

6. In vitro wound healing assay 39

7. Primary dermal fibroblast contraction assay 39

8. Primary dermal fibroblast adhesion assay 40

9. Protein extraction and Western blot running 40

10. Hematoxylin and Eosin, Masson's trichrome staining 43

11. Real-time polymerase chain reaction 43

12. Adenovirus infection for reintroduction of CRBN in vitro 45

13. Adenovirus infection for the reintroduction of CRBN in the wound tissue of mice 46

14. Statistical analysis 46

Ⅳ. RESULTS 47

1. CRBN ablation delayed wound healing in mice 47

2. In wound tissue, the expression of CRBN changed over time 52

3. For the in vitro study, primary dermal fibroblast was extracted and validated 53

4. The ablation of CRBN on dermal fibroblasts led to a significant decrease in the proliferation, migration, and contraction ability of cells 59

5. CRBN ablation led to an impairment of the ERK1/2-SMAD2/3 axis in the fibroblast and decreased fibroblast proliferation and myofibroblast activation markers 64

6. In vivo, wound tissue of CRBN KO mice imbalanced of cytokines and growth factors TGFβ, FGF1, PDGFα, and TNFα 68

7. Impairment of the ERK1/2-SMAD2/3 axis decreases the fibroblast proliferation and myofibroblast activation markers in wound tissue of CRBN KO mice 70

8. CRBN KO fibroblasts infected with Ad-CRBN recovered the proliferation and improved migration ability 73

9. Reintroduction of CRBN into CRBN KO fibroblasts restored the ERK1/2-SMAD2/3 axis and cell proliferation, myofibroblast activation markers 77

10. Reintroduction of CRBN into CRBN KO mice recovered the wound healing process 80

11. Wound tissue in CRBN KO mice infected with Ad-CRBN restored TGFβ, FGF1, PDGFα, and TNFα signal balance 84

12. Wound tissue of CRBN KO mice infected with Ad-CRBN improved the ERK 1/2-SMAD2/3 and cell proliferation and myofibroblast activation markers 87

Ⅴ. DISCUSSION 90

1. CRBN ablation delayed wound healing both in vivo and in vitro 96

2. CRBN deficiency led to imbalanced wound healing cytokines, growth factors, and impaired ERK1/2-Smad2/3 axis in fibroblasts 102

3. Reintroduction of CRBN into the CRBN KO fibroblast and mouse wound tissue improved wound healing 106

4. Future plan 109

Ⅵ. CONCLUSION 111

REFERENCES 113

List of Tables 8

Table 1. Worldwide wound incidence 20

Table 2. List of antibodies for Western blot running 42

Table 3. List of primers for RT-PCR running 44

List of Figures 9

Figure 1. Contribution to the wound healing process 24

Figure 2. Multiple functions of CRBN 29

Figure 3. Experiment design 34

Figure 4. CRBN KO mice impaired wound healing 49

Figure 5. CRBN KO mice decreased the establishment of the new... 50

Figure 6. Ablation of CRBN decreased extracellular matrix... 51

Figure 7. CRBN expression in wound tissue 52

Figure 8. Extraction and culture of the primary dermal fibroblasts... 55

Figure 9. The primary cell extracted from the mouse ear was... 56

Figure 10. Validation of the primary dermal fibroblasts 57

Figure 11. CRBN KO fibroblasts decreased CD140a expression... 58

Figure 12. CRBN ablation delayed proliferation in fibroblasts 61

Figure 13. In vitro wound healing assay, CRBN KO fibroblasts... 62

Figure 14. CRBN ablation decreased the contraction of collagen... 63

Figure 15. Impairment of the ERK1/2-Smad2/3 axis in CRBN KO... 65

Figure 16. In vitro, CRBN deficiency inhibited cell proliferation... 66

Figure 17. CRBN ablation decreased Ki67 and α-smooth actin... 67

Figure 18. In vivo, CRBN KO mice impaired TGFβ, FGF1, PDGF,... 69

Figure 19. CRBN ablation led to a decrease ERK1/2-SMAD2/3... 71

Figure 20. In vivo, CRBN ablation decreased myofibroblast... 72

Figure 21. CRBN was reintroduced into primary fibroblasts 74

Figure 22. Ad-CRBN restored proliferation in CRBN KO... 75

Figure 23. Ad-CRBN recovered the migration and contraction... 76

Figure 24. Reintroduction of CRBN into CRBN KO fibroblast... 78

Figure 25. CRBN KO fibroblasts infected by Ad-CRBN improved... 79

Figure 26. Reintroduction of CRBN into CRBN KO mice recovered... 81

Figure 27. Ad-CRBN put back the wound healing regenerative... 82

Figure 28. Reintroduction of CRBN into CRBN KO mice restored... 83

Figure 29. Ad-CRBN improved TGFβ, FGF1, PDGFα, and TNFα... 85

Figure 30. The reintroduction of CRBN did not affect the EGF,... 86

Figure 31. Ad-CRBN rescued the TGFβ-ERK1/2-SMAD2/3 axis... 88

Figure 33. CRBN deficiency impairs wound healing 112

초록보기

목적

세레브론 (CRBN)은 대사 조절, 세포막 항상성 유지, 세포 노화 등 다양한 생리적 과정에 관여하는 다기능 단백질이다. 상처 치유는 여러 단계와 다양한 세포 간의 상호작용이 포함된 복잡한 과정이며, 이 중 섬유아세포의 이동과 활성화는 조직 복구 및 흉터 형성에 핵심적인 역할을 한다. 본 연구는 상처 치유 과정에서 CRBN 의 역할을 규명하고, 이 단백질이 섬유아세포 기능과 관련된 분자적 기전을 통해 상처 치유에 미치는 영향을 분석하는 것을 목적으로 한다.

방법

생체 내 연구에서는 8~10 주령의 수컷 야생형(WT) 및 CRBN 결손(KO) 마우스의 귀 천공 모델을 이용하여 4 주 동안 상처 치유 과정을 추적하였다. 조직 검사는 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색 및 마쏜 삼색(MT) 염색을 이용하여 수행되었으며, Western blot과 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통해 단백질 및 mRNA 발현을 분석하였다. 시험관 내 연구에서는 마우스 귀에서 1 차 피부 섬유아세포를 분리하여 증식, 이동, 수축 능력을 평가하였으며, 아데노바이러스 감염을 통해 CRBN 을 CRBN KO 섬유아세포 및 CRBN KO 마우스 상처 조직에 재도입하여 기능적 변화를 분석하였다.

결과

CRBN 결손은 섬유아세포 증식을 감소시키고 근섬유아세포 활성화를 저해하여 상처 치유를 지연시키는 것으로 나타났다. 또한 CRBN KO 마우스에서는 TGF-β, FGF1, PDGF-α, TNF-α 등의 사이토카인 및 성장 인자 신호의 불균형이 관찰되었으며, ERK1/2-SMAD2/ 기능이 저하되었다. CRBN 을 결손된 섬유아세포 및 상처 조직에 재도입한 결과, 섬유아세포 증식, 근섬유아세포 활성화 기능이 회복되고 상처 치유가 촉진됨을 확인하였다.

결론

CRBN 은 섬유아세포 증식과 근섬유아세포 활성화에 중요한 역할을 하며, 효과적인 상처 치유에 필수적인 단백질임이 확인되었다. 본 연구 결과는 CRBN 이 상처 치유 촉진 및 세포 성장 질환 치료의 새로운 표적이 될 가능성을 시사한다.

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