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Title Page 2

Contents 5

Abstract 11

1. Introduction 13

2. Materials & Methods 17

2.1. Fish 17

2.2. Cell culture 18

2.3. Virus propagation and titer determination 19

2.4. Identification and cloning of HsTNF-α sequence 20

2.5. Sequence analysis of HsTNF-α 22

2.6. In vivo expression analysis of HsTNF-α 23

2.6.1. Tissue distribution of HsTNF-α mRNA 23

2.6.2. Expression profiles of HsTNF-α after NNV challenge 24

2.7. Construction of the HsTNF-α expression plasmid 26

2.8. Over-expression and purification of rHsTNF-α 27

2.9. SDS-PAGE 29

2.10. Western blotting assay 30

2.11. Cell viability 31

2.12. Preparation of plasmid DNA standards 32

2.13. Evaluation of rHsTNF-α activity 33

2.14. Statistical analysis 34

3. Results 35

3.1. The identification and bioinformatics analysis of HsTNF-α 35

3.2. Analysis of HsTNF-α mRNA expression in different tissues 41

3.3. Expression analysis of HsTNF-α in various tissues with NNV challenge 43

3.4. Production and purification of rHsTNF-α 45

3.5. Cytotoxicity assessment of rHsTNF-α 49

3.6. Antiviral effects of rHsTNF-α in SSN-1 cells 51

3.7. Evaluation of rHsTNF-α induced gene expression 55

4. Discussion 58

5. 국문 초록 65

6. References 67

List of Tables 8

Table 1. Primers used for cloning and sequencing 21

Table 2. Primer sequences used for real-time PCR 25

List of Figures 9

Figure 1. Nucleotide and amino acid sequences analysis of HsTNF-α. The lowercase... 37

Figure 2. Bioinformatic analysis of HsTNF-α. (A) A schematic view of HsTNF-α pro-... 38

Figure 3. Multiple alignment of HsTNF-α amino acid sequences with other fishes and... 39

Figure 4. Phylogenetic analysis of HsTNF-α sequences and other species of TNFs. The... 40

Figure 5. Tissue distribution of HsTNF-α mRNA of healthy sevenband grouper. The... 42

Figure 6. In vivo mRNA expression profile of HsTNF-α mRNA following challenge... 44

Figure 7. Production of recombinant HsTNF-α (rHsTNF-α) expressed in E. coil at dif-... 46

Figure 8. SDS-PAGE analysis of rHsTNF-α expression under different IPTG concen-... 47

Figure 9. SDS-PAGE (A) and western blot analysis (B) of rHsTNF-α expression and... 48

Figure 10. Cytotoxicity of rHsTNF-α on SSN-1 cells. SSN-1 cells were incubated with... 50

Figure 11. Antiviral effects of rHsTNF-α in SSN-1 cells. SSN-1 cells were pre-treated... 53

Figure 12. Antiviral activity of rHsTNF- α in SSN-1 cells. Cells were pre-treated with... 54

Figure 13. Expression of genes involved in TNF-mediated signaling pathways follow-... 57

초록보기

 Tumor necrosis factor (TNF)는 면역 조절에 관여하는 주요 염증성 사이토카인으로, 본 연구에서는 능성어 유래 NTF 유전자를 클로닝하고, 해당 유전자를 E.coli 를 기반으로 재조합 단백질로 발현시킨 후, NNV 에 대한 항바이러스 및 단백질 효과를 in vitro 에서 평가하였다. 전장 cDNA 는 279 bp 의 5'-UTR 과 63bp 의 5'-UTR, 총 253 개의 아미노산을 암호화하는 762 bp 의 ORF 로 구성되며, 서열 내에는 막 관통 도메인과 TACE 절단 부위, TNF 유사 도메인을 포함하고 있다. 발현용 벡터에 삽입하여 재조합 TNF 단백질을 합성하였으며, 발현된 단백질은 His-tag 을 이용해 정제되었다. SDS-PAGE 및 western blot 을 통해 20.5 kDa 의 크기의 단백질을 확인하였다. 재조합 단백질을 SSN-1 세포주에 처리하여 NNV 의 RNA2 copy 수 감소를 확인하였으며, TNF pathways 관련 유전자들의 유도를 전사 수준에서 확인하였다. 따라서, 이러한 E. coli 유래 발현 시스템의 구축은 어류용 백신 후보 단백질이나 면역 유도제의 효율적 생산을 가능하게 하며, 이는 양식 산업에서의 질병 관리와 예방에 기여함으로써 경제적 손실을 줄이는 데 중요한 기반을 제공할 것이다.

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