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Title Page 2

Contents 5

ABSTRACT 12

CHAPTER 1. Introduction 15

1-1. Background 15

1-2. Research Trends 20

1-3. Research Objective 25

1. Development and characterization of cascade bioprinting technique 25

2. Development of computational fluid dynamics (CFD) model and investigation of process parameters for cascade bioprinting 25

3. Fabrication of highly vascularized hepatic tissue using cascade bioprinting 25

1-4. Dissertation Organization 26

CHAPTER 2. Development and Characterization of Cascade Bioprinting 28

2-1. Introduction 28

2-2. Results and Discussion 31

2-2-1. Cascade bioprinting 31

2-2-2. Characterization for cartridge-free method 33

2-2-3. Characterization of cartridge-based method 36

2-2-4. Evaluation of advantages of cascade bioprinting technique 39

2-2-5. Bioprinted constructs via cascade bioprinting 43

2-3. Summary 48

CHAPTER 3. Development of Computational Fluid Dynamics Model and Investigation of Process Parameters for Cascade Bioprinting 49

3-1. Introduction 49

3-2. Results and Discussion 52

3-2-1. Establishment of CFD model 52

3-2-2. Application of CFD model to reprinting process 55

3-2-3. Effect of pressure 57

3-2-4. Effect of nozzle diameter 59

3-2-5. Effect of nozzle shape 61

3-2-6. Effect of syringe outlet angle 64

3-2-7. Influence of height of precursor cartridge 66

3-2-8. Fabrication of structures with complex cross-sectional geometries 68

3-3. Summary 71

CHAPTER 4. Fabrication of Highly Vascularized, Microstructured Hepatic Tissues using Cascade Bioprinting Technique 72

4-1. Introduction 72

4-2. Results and Discussion 77

4-2-1. Design of cascade bioprinting process 77

4-2-2. Fabrication of highly vascularized hepatic tissue 80

4-2-3. Assessment of hepatic tissue functionality 83

4-2-4. Evaluation of metabolic ability 85

4-2-5. Assessment of angiogenic ability 88

4-3. Summary 91

CHAPTER 5. Conclusion and Future Works 92

5-1. Summary and Conclusion 92

5-2. Future Works 93

Experimental Section 94

References 105

한글 요약문 (Summary in Korean) 115

List of Tables 11

Table S1. Material properties of collagen hydrogels used in this research 95

Table S2. Material properties of hydrogels used in this research 96

List of Figures 8

Figure 1-1. Schematic illustration for spheroids and organoids 18

Figure 1-2. The four representative technologies of 3D bioprinting. (A) Extrusion-... 19

Figure 1-3. Fabrication of tissue structure with high resolution using (A) microfluidic... 22

Figure 1-4. 3D printing-based technique for fabricating tissue constructs with microscale... 23

Figure 1-5. Schematic illustration of microstructures within native tissue. (A) Skeletal... 24

Figure 1-6. Schematic diagram of dissertation organization and objectives 27

Figure 2-1. A representative example on non-mixing property of Stokes flow 30

Figure 2-2. Introduction to the cascade bioprinting technique. (A) Schematic illustration... 32

Figure 2-3. Evaluation of characteristics of cartridge-free method. (A) An illustration of... 35

Figure 2-4. Assessment of advantages for cartridge-based method. (A) Experimental setup... 38

Figure 2-5. Advantage of the cascade bioprinting technique 1. High spatial resolution... 41

Figure 2-6. Advantage of the cascade bioprinting technique 2. Induction of cell alignment... 42

Figure 2-7. Examples of bioprinted constructs fabricated using the cascade bioprinting... 46

Figure 2-8. Fabrication of a highly vascularized liver lobule-like tissue construct using the... 47

Figure 3-1. An example of mismatch between the bioink structure within the syringe and... 51

Figure 3-2. Introduction and validation of the CFD model. (A) Description of the... 54

Figure 3-3. Prediction of reprinting outcomes using the CFD model. Experimental data... 56

Figure 3-4. Evaluation of the effect of applied pneumatic pressure in cascade bioprinting on... 58

Figure 3-5. Assessment of the influence of the nozzle size on the cascade bioprinting... 60

Figure 3-6. Evaluation of the effect of nozzle shape on cross-sectional pattern formation.... 63

Figure 3-7. Assessment of the effect of exit slope angle on cross-sectional pattern formation.... 65

Figure 3-8. Evaluation of the impact of precursor cartridge height on bioprinted outcomes.... 67

Figure 3-9. CFD design and experimental results for fabricating structures with... 70

Figure 4-1. The microvascular structures in human liver. Asterisks and black arrow indicate... 75

Figure 4-2. Fabrication of tissue construct hepatic lobule-like cross-sectional pattern using... 76

Figure 4-3. Design of process parameters for the fabrication of structured and... 79

Figure 4-4. Fabrication results of nonstructured, structured, and microstructured hepatic... 82

Figure 4-5. Hepatic functionality assessment of bioprinted tissue. (A) Live/Dead staining... 84

Figure 4-6. Evaluation for metabolic functions of the bioprinted hepatic tissue. (A)... 87

Figure 4-7. Evaluation of angiogenic capacity of bioprinted hepatic tissue. (A) Observation... 90

List of Supplementary Figures 10

Figure S1. Viscosity profile of collagen and alginate used in this research 95

초록보기

 장기 이식에서, 장기 이식 대기자는 지속적으로 늘어나고 있지만 장기의 부족으로 인하여 대기 중 사망자 수가 매년 증가하고 있다. 또한, 인체에 적용되는 약물, 화장품, 화학물질의 안전성이나 유효성을 검증하기 위해 동물실험이 시행되고 있으며, 이 수는 매년 증가하여 윤리적 문제가 대두되고 있다. 따라서, 인체의 손상되거나 기능을 잃은 장기를 대체하거나 동물실험을 대체할 수 있는 인공 조직/장기 제작이 요구되며, 성공적인 인공 조직/장기는 인체 조직의 기능성과 최대한 유사해야 한다. 이러한 점을 달성하기 위하여 최근 인체 조직에 존재하는 미세 구조를 모방하는 것이 중요하다는 사실들이 밝혀지면서 체내에 존재하는 미세 구조를 구현할 수 있는 인공 조직 제작 기술 개발이 요구되고 있다. 한편, 3D 바이오프린팅 기술은 프로그램으로 제어되는 3차원 프린팅 시스템을 이용하여 원하는 위치에 원하는 세포를 위치시켜 3차원의 인공 조직을 제작할 수 있는 기술로, 인체 내 존재하는 혈관이나 피부의 층상 구조를 모방하여 성공적으로 고기능성 인공 조직을 제작하였다. 그럼에도 불구하고, 체내 미세 구조를 모방하기 위해서 간소엽이나 모세혈관 구조 등 체내 존재하는 이질적이며 미세한 구조를 구현하기에는 정밀도가 낮은 한계가 있다. 이를 극복하기 위해 다중재료 바이오프린팅 기술이 개발되었고 이를 이용해 구조화된 조직구조체 제작에 적용되었지만, 체내에 존재하는 미세 구조와 유사한 수준의 복잡한 미세 구조를 구현하는 데에는 바이오프린팅에 사용되는 시린지 치수의 한계, 하이드로젤의 낮은 강성, 특성화된 적층 공정의 요구 등으로 한계점이 존재한다. 따라서, 본 연구에서는 체내에 존재하는 복잡하고 미세한 구조를 구현하기 위한 3차원 바이오프린팅 기술 개발을 수행하였다.

3차원 바이오프린팅 기술은 높은 점도를 갖는 하이드로젤을 직경이 작은 노즐을 통해 낮은 속도로 토출시키며 3차원 구조체를 제작하는 기술로, 유체 역학적인 관점에서 유체의 점성력이 관성력에 비해 지배적인 저- 레이놀즈 수 유동이 발생하는 특징이 있다. 레이놀즈 수가 작으면 서로 다른 두 유체는 단일 채널에서 동시에 흐를 때 혼합이 일어나지 않는 특징이 있다. 이러한 저- 레이놀즈 수 유동의 특징을 이용하여, 바이오프린팅 공정에 적용되는 하이드로젤을 시린지 내에 원하는 패턴으로 사전 위치시킨 후 이를 노즐을 통해 출력하면 출력된 구조체의 단면에 시린지에 사전 위치된 하이드로젤의 단면 패턴이 서로 혼합되지 않고 축소된 형태로 구현될 것이다. 나아가, 이 과정을 반복한다면 즉, 출력을 다른 하이드로젤을 담지하고 있는 시린지 내에 수행하고 이를 재출력한다면 최초 출력된 구조체 단면에 존재하는 패턴이 두 번째 시린지에 존재하는 하이드로젤과 혼합되지 않고 노즐을 통해 재 축소될 것이다. 본 연구에서는 이러한 유체역학적 가정을 이용해 인체 조직에 존재하는 복잡하고 미세한 구조를 구현할 수 있는 고정밀 바이오프린팅 기술로써 활용하였고, 이를 Cascade Bioprinting 기술로 명명하였다. 여기서, 시린지 내에 하이드로젤들을 사전 위치시킬 수 있는 방법으로 본 연구에서는 두 가지 전략을 제시하였다. 시린지 내에 노즐을 이용해 직접 프린팅 하여 위치시키는 방법과 3차원 프린팅으로 제작한 전구체 카트리지 내에 프린팅 한 후 이를 시린지로 옮겨 담는 방법이다. 이렇게 서로 다른 두 방법이 재 출력된 바이오프린팅 구조체 내의 단면 패턴 형성에 주는 영향을 실험적으로 평가하는 연구를 수행하였다. 그리고, Cascade bioprinting 기술이 가지는 장점을 평가하였다. 먼저, Cascade bioprinting 공정은 층류 유동 특성을 활용하기에 유체의 혼합이 잘 일어나지 않아 재 출력 공정을 지속적으로 반복하면 50 um 이하의 이질성 패턴 구현이 가능할 정

도로 정밀도가 높음을 검증하였다. 또한, 재 출력되는 과정은 유체역학적으로 Extensional flow가 발생하는 공정이며, 이 공정은 생체재료를 이루는 분자의 프린팅 방향으로의 정렬을 유도할 수 있다. 이로 인해 프린팅 된 구조체 내에 존재하는 세포는 프린팅된 필라멘트의 길이 방향으로 정렬이 유리하다는 점을 확인하였다. 이렇게 개발된 Cascade bioprinting 기술을 이용하여 척수에 존재하는 Grey matter, 근섬유 다발 등과 유사한 체내 이질성, 미세 구조를 구현할 수 있음을 확인하였고, 실제 세포를 이용하여 고도로 사전 혈관화 된 간조직을 프린팅하는데 성공하였다.

한편, Cascade bioprinting 기술 개발과정에서, 시린지 내 구현한 단면 패턴의 형상은 항상 프린팅된 필라멘트의 단면 형상과 일치하지 않는다는 점이 확인되었으며, 이는 전구체 카트리지 형상, 하이드로젤 선정 등에 있어 많은 시행착오를 요구하여 마이크로 구조를 갖는 조직 구조체를 제작하는데 있어 효율을 떨어트리는 문제를 야기시켰다. 따라서, Cascade bioprinting 공정의 결과물을 사전에 예측할 수 있는 기술이 개발된다면 Cascade bioprinting 공정의 효율성을 높여줄 것이며, Cascade bioprinting 공정에 국한되지 않고 다중재료 바이오프린팅 공정 전반에 걸쳐 적용되어 3D바이오프린팅 기술개발에 적용될 수 있다. 이에 본 연구에서는 전산 유체역학을 도입하여 Cascade bioprinitng 공정의 결과물을 예측할 수 있는 모델을 개발하였다. Cascade bioprinting 공정이 갖는 층류 유동 특성을 이용하여 모델을 확립하고 전산 유체역학을 통해 예측된 Cascade bioprinting 공정 결과물, 특히, 필라멘트의 단면 형상을 실험 결과와 비교하여 본 연구에서 개발한 다중재료 바이오프린팅 공정 결과물 예측 모델이 Cascade bioprinting 공정 결과를 예측할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 출력된 필라멘트 단면 패턴에 영향을 주는 공정 변수 도출을 전산 유체역학 모델을 이용하여 효율적으로 도출하여 Cascade bioprinting 공정의 사전 설계가 가능함을 확인하였다.

간은 체내에서 중요한 역할을 담당하며, 약물 대사를 수행하기에 인공 장기및 체외 약물 평가 모델 적용을 위한 인공 간 개발이 요구된다. 간은 고도로 발달된 혈관 네트워크를 가진 조직이다. 이런 혈관 구조는 큰 부피의 간 조직 곳곳에 효과적인 물질 전달을 가능하게 하여 간세포 및 비실질세포에 의한 대사 효율이 극대화하는데 결정적인 역할을 한다. 하지만 기존의 바이오제조 방법은 낮은 공간 해상력으로 인하여 구현하고자 하는 혈관 크기에 한계가 있다. 나아가, 앞서 언급한 기존의 다중재료 바이오프린팅 기술 또한 프린팅 한 조직 구조체 내에 존재하는 혈관구조를 구현할 수 있지만, 체내와 유사한 수준의, 높은 밀도의 복잡한 혈관 구조를 구현하는데 효율적이지 못하다. 본 연구에서 개발한 Cascade bioprinting 기술은 높은 정밀도와 함께 체내에 존재하는 복잡한 미세구조를 간단한 시스템으로 구현하는데 효율적임이 확인되었다. 따라서, 기존 기술과 다르게 조직 구조체 내에 모세혈관 구조를 고밀도로 배치하는 것이 가능하며 이는 물질전달 효율을 높여 향상된 간조직 기능성을 가는 조직 구조체 제작이 가능할 것으로 가정하였다. 이를 제작하기 위해 앞서 개발한 전산 유체역학 모델을 이용하여 전구체 카트리지, 시린지, 노즐등의 공정변수를 사전 설계하여 효율적으로 미세 모세혈관 구조가 고밀도로 구현된 간 조직 구조체를 제작하였다. 이렇게 제작된 미세 구조를 갖는 간 조직 구조체는 구조를 갖지 않으며, 조직 구조체를 이루는 세포가 균일하게 혼합된 형태의 조직 구조체나 단순한 혈관 구조를 갖는 조직구조체에 비해 높은 단백질 합성 능력, 약물, 독성물질 대사 능력, 신생혈관작용 능력을 가지고 있음을 확인하였다.

결과적으로, 본 연구에서 개발한, 미세한 구조를 구현할 수 있는 다중 재료 바이오프린팅 기술인 Cascade bioprinting은 미세 구조를 갖는 조직 구조체를 효율적으로 제작할 수 있으며, 잠재적으로 향상된 조직 기능성을 갖는 인공장기 및 체외 약물 평가 모델 제작에 활용할 수 있을 것이다.

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