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The majority of cellular energy, in the form of ATP is produced through the oxidative phosphorylation system, consisting of the electron transport chain and ATP synthase in mitochondrial inner membrane. Mammalian cytochrome c oxidase (COX) is the last enzyme in electron transport chain and irreversibly catalyzes O2 to H2O using electrons received from cytochrome c. While the electrons are transferred, COX pumps protons to the intermembrane space of the mitochondria and this proton gradient as a major part of the membrane potential is utilized by ATP synthase to produce ATP. COX is suggested to be a rate limiting step in the electron transport chain under physiological conditions and its activity is tightly regulated by several means, such as isoform expression, protein phosphorylation, and allosteric regulation. These regulatory mechanisms of COX were further studied in this thesis, specifically by investigating different tissue specific isoform expression, cAMP dependent protein phosphorylation, and palmitate binding. Amino acid sequencing of purified COX from turkey liver, heart, and skeletal muscle demonstrated the heart type isoform of subunit VIa (VIaH) does not exist in turkey heart and muscle unlike bovine, but only liver type isoform of subunit VIa (VIaL) presents in all tissues. Therefore it is expected that the tissue specific regulation of subunit VIaH does not present in turkey. Recently discovered isoform subunit IV-2 containing two cysteines not found in IV-1 was proposed to be expressed mainly in lung by Northern analysis, but its existence has not been confirmed due to the lack of a specific antibody. Here bovine lung COX was isolated using a modified protocol and subunit IV-2 containing cysteines were identified by DACM, a fluorescent thiol reactive reagent. The allosteric ATP-inhibition of cytochrome c oxidase (second mechanism of respiratory control) was investigated in more detail. Its reversible turning on by cAMP dependent phosphorylation with protein kinase A and off by dephosphorylation with protein phosphatase 1 was demonstrated. This allosteric ATP-inhibition is observed not only in bovine heart, but also testes and kidney. By screening for possible phosphorylation sites in bovine heart enzyme and by the topology of the phosphorylation site, Ser441 on the cytosolic side of catalytic subunit I was suggested to be phosphorylated and turns on the allosteric ATP-inhibition. H+/e- stoichiometry, a ratio of pumped proton per transferred electron of the enzyme, is directly related to production of ATP and heat. The H+/e- ratios of bovine heart COX containing subunit VIaH was previously shown to be reduced from 1.0 to 0.5 in the presence of high intramitochondrial ATP/ADP ratios. In contrast, bovine liver enzyme containing subunit VIaL revealed H+/e- ratios of 0.5 independent of ATP/ADP ratios. The difference was due to the isoforms of subunit VIa. Here it was demonstrated that the presence of 1 % cardiolipin in the liposome during reconstitution of the bovine kidney COX containing same subunit compositions to liver enzyme resulted in H+/e- ratios of 1.0. Cardiolipin is reported to be essential for full function of several mitochondrial proteins. This high proton pumping efficiency could be reduced to H+/e- ratios of 0.5 by the most commonly found fatty acid, palmitate (C16:0, half-maximal effect at 0.5 μM), in the presence of cardiolipin, but not by laurate (C12:0), myristate (C14:0), stearate (C18:0), oleate (C18:1), cetylalcohol (C16-OH), palmitoyl-CoA, or palmitoyl-glycerol. Cardiolipin and palmitate had no effect on the heart COX. The controlled respiration of the reconstituted kidney enzyme, but not of the heart enzyme, was specifically increased by palmitate. Our results suggest that the reduction in proton pumping efficiency by palmitate in COX from non-muscle type tissues (containing subunit VIaL) might participate in thermogenesis of mammals.

생체에너지인 ATP의 대부분은 미토콘드리아의 전자전달계와 ATP합성효소로 구성된 산화성 인산화시스템을 통해서 생산된다. 포유류의 시토크롬씨 산화효소 (콕스)는 이 전자전달계의 마지막과정 효소이며, 시토크롬씨에서 받은 전자를 이용하여 비가역적으로 산소를 물로 변환시킨다. 전자가 전달되는 동안 콕스는 수소이온을 미토콘드리아의 내외막 사이로 능동수송하며, 이로 인한 수소양이온의 농도차이는 미토콘드리아의 막전위를 구성하는 주요요소가 되며, 이를 사용하여 ATP생성효소는 에너지를 생성한다. 콕스는 생리학적 조건하에서 전자전달계의 중요한 속도제한 단계라고 제시되어지는데, 효소활성은 동위효소 발현, 단백질 인산화, 그리고 allosteric인자의 결합에 의해 조절된다. 이 논문에서는 조직특이적 동위효소 발현, cAMP(고리형 AMP)의존적 인산화, 그리고 팔미테이트 결합에 의한 조절을 심층적으로 연구하였다. 칠면조의 간, 심장, 그리고 근육에서 추출한 콕스의 아미노산 서열을 조사한 결과 소와는 달리 칠면조의 심장과 근육효소는 심장형 소단위체 동위효소 (VIaH) 없이 간형 동위효소(VIaL)만으로 이루어져 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 칠면조에서는 소단위체 VIa의 조직특이 동위효소 발현에 의한 효소활성의 조절이 없을 것으로 추정되었다. 최근에 발견된, 소단위체 IV-1과는 달리 두개의 시스테인을 포함하고 있는 동위효소 IV-2는 노던법검사 결과 주로 폐에서 발현되어지는 것으로 밝혀졌으나, 특이항체의 부재 관계로 아직 그 존재가 확인되고 있지않다. 이에 소허파에서 콕스를 추출후 형광 티올 반응물질인 DACM을 처리함으로써 IV-2가 존재함을 확인하였다. 세포호흡조절의 제 2 기작으로 제시되는 콕스의 allosteric ATP-inhibition을 연구한 결과 단백질 키나이제 A에 의한 고리형 AMP 의존적 인산화에 의해서 턴 온되며, 단백질 포스파타아제1에 의한 탈인산화에 의해서 턴 오프되어짐이 관찰되었다. 이러한 allosteric ATP-inhibition은 소의 심장 콕스 뿐만아니라, 정소와 신장의 효소에서도 나타났다. 소심장 효소를 이용한 인산화 가능성 자리 검색과 인산화 자리 접근성 추정 결과, 촉매소단위체 I의 441번 세린이 allosteric ATP-inhibition을 일으키는 아미노산으로 제안되었다.H+/e- stoichiometry는 효소내에서 하나의 전자가 전달되는 동안 펌프된 수소이온의 갯수를 말하며,이는 미토콘드리아의 ATP와 열 생성에 직접 연관되어 있다. 심장형 동위효소 (VIaH)를 포함하는 소심장 콕스의H+/e- ratios는 미토콘드리아 내의 ATP/ADP 비율이 높은 경우 1.0에서 0.5로 낮아지는 것으로 보고되었다. 하지만 간형 동위효소 (VIaL)를 포함하는 소간 콕스는 ATP/ADP비율에 상관없이 항상 0.5로 낮은것으로 나타났으며,이 차이는VIa 의 동위 소단위체에 의한 것으로 알려졌다. 이 논문에서는 간 효소와 똑같은 소단위체를 갖고 있는 소신장 콕스를 리포솜안에 재구성할때1% 카르디올리핀을 넣어주면H+/e- ratios가 1.0으로 증가함을 보였다. 카디오리핀은 미토콘드리아의 여러 효소들의 활성에 중요한 역할을 한다고 알려진 지질이다. 카디오리핀의 첨가로 증가된 수소이온의 능동수송은 팔미테이트(C16:0, 반최고효과 농도는 0.5 μM) 첨가시에 다시 0.5로 낮아진다. 하지만 다른 지방산인 라우레이트(C12:0), 미리스테이트(C14:0), 스테아레이트(18:0), 올리에이트(C18:1), 세틸알코올(C16-OH), 팔미토일 CoA, 그리고 팔미토일 글리세롤은 아무 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 소신장 효소의 조절호흡은 팔미테이트에 의해서 증가하였으나, 심장효소는 아무 변화가 없는것으로 밝혀졌다. 이는 비근육성 조직의 콕스에 팔미테이트가 결합함으로써 나타나는 수소이온 능동수송 효율 감소가 포유류의 열발생에 관여할 것으로 제시되어진다.

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