목차

표제지=0,1,1

제출문=0,2,1

요약문=i,3,7

SUMMARY=viii,10,7

CONTENTS=xv,17,6

LIST OF TABLE=xxi,23,2

LIST OF FIGURERS=xxiii,25,3

목차=1,28,9

제1장 연구개발과제의 개요=10,37,1

제1절 연구개발의 목적 및 필요성=10,37,3

제2절 연구개발 목표=12,39,1

1. 연구개발 목표와 내용=12,39,2

2. 연차별 연구개발 목표와 내용=13,40,1

제2장 국내외 기술개발 현황=14,41,1

제1절 세계시장 동향=14,41,1

제2절 연구동향=14,41,3

제3장 연구개발수행 내용 및 결과=17,44,1

제1절 혈전용해능 우수 버섯균 선발=17,44,1

1. 서론=17,44,3

2. 재료 및 방법=19,46,1

가. 공시균주 및 재료=19,46,2

나. 균사체 배양=20,47,1

다. 조효소 추출=20,47,1

라. 혈전용해활성 측정=21,48,1

3. 결과 및 고찰=21,48,1

가. 버섯균 배양액의 혈전용해 활성=21,48,2

나. 버섯균 배양 균사체의 혈전용해활성=22,49,1

다. 버섯 자실체 의 혈전용해활성=22,49,2

라. 기능성 버섯류 선발을 위한 버섯균에 따른 균사체 생산능 비교=23,50,1

마. 균사체 활용에 따른 경제적 효과=23,50,7

4. 적요=30,57,1

가. 버섯균사 배양액을 이용한 혈전분해 활성=30,57,1

나. 버섯배양 균사체를 이용한 혈전분해 활성=30,57,1

다. 인공배양 버섯균 자실체를 이용한 혈전분해활성=30,57,1

라. 혈전분해 활성 유망버섯 선발=30,57,1

제2절 뽕나무버섯 균사체로부터 혈전분해효소 정제 및 특성분석=31,58,1

1. 서론=31,58,4

2. 재료 및 방법=34,61,1

가. 뽕나무버섯 균사체의 단백질분해활성 및 혈전분해활성 검색=34,61,2

나. 뽕나무버섯 균사체로부터 혈전분해효소 정제 및 특성분석=35,62,1

1) 시료=35,62,1

2) 조단백질 분리=35,62,2

3) 단백질 정량=36,63,1

4) 단백질 분리=36,63,1

가) lon-exchange chromatogrphy=36,63,1

(1) Cation-exchange column chromatography=36,63,1

(2) Anion-exchange column chromatography=36,63,2

나) Gel filtration=37,64,1

5) 활성 분획 분리=37,64,1

6) 혈전분해작용 및 활성 측정=37,64,2

7) 혈전분해효소의 분자량 측정=38,65,1

가) SDS-PAGE=38,65,1

나) Fibin-zymography=38,65,2

8) N-terminal sequence anaysis=39,66,1

9) In vitro와 in vivo에서 혈전분해효과 검증=39,66,1

가) In vitro에서 혈전분해 효과=39,66,1

나) In vivo에서 혈전분해 효과=39,66,2

10) 혈전분해 효소 특정 분석=40,67,1

가) 금속이온에 대한 혈전분해효소 활성 측정=40,67,1

나) pH에 대 한 혈 전분해 효소 활성 측정=40,67,1

다) 온도에 대한 혈전분해효소 활성 측정=41,68,1

라) 다양한 기질에 의한 혈전분해 특성 분석=41,68,1

마) Fibrin 및 fibrinogen에 대한 혈전분해 특성 분석=41,68,1

다. 뽕나무버섯 균사체로부터 혈전분해효소 유전자 크로닝=41,68,1

1) 시료=41,68,2

2) Total RNA 분리=43,70,1

3) RT(Reverse Transcriptase)-PCR=43,70,1

4) 뽕나무버섯혈전분해효소 유전자에 대한 특이적 primer의 제작=43,70,1

5) 뽕나무버섯균사체로부터 혈전분해효소 유전자 탐색=43,70,2

라. 유전자크로닝=44,71,3

마. DNA sequence analysis=46,73,2

3. 결과 및 고찰=48,75,1

가. 뽕나무버섯 균사체의 단백질분해활성 및 혈전분해활성=48,75,1

1) 뽕나무버섯의 단백질분해활성=48,75,1

2) 뽕나무버섯의 혈전분해 활성 검색=48,75,4

나. 뽕나무버섯 균사체로부터 단백질 분리 정제=52,79,1

1) 에탄올 침전법에 의한 조단백질의 분리=52,79,1

2) 혈전분해효소의 정제=52,79,8

다. 정제된 혈전분해효소의 특성 분석=59,86,1

1) 정제된 혈전분해 효소의 분자량 결정=59,86,2

2) 분리정제된 혈전분해효소의 in vitro 와 in vivo에서 혈전분해효과 검증=60,87,2

3) 금속이온 및 단백질 분해효소 억제제에 대한 혈전분해효소 활성 측정=61,88,1

4) pH 및 온도에 대한 혈전분해효소의 활성 측정=61,88,3

5) 다양한 기질에 의한 혈전분해효소의 특성 분석=63,90,1

6) Fibrin 및 fibrinogen에 대한 혈전분해 특성 분석=63,90,1

가) 정제된 효소에 의한 Fibrin의 혈전분해 특성=63,90,7

나) 정제된 효소에 의한 fibrinogen의 분해특성=69,96,1

라. 뽕나무버섯 균사체의 혈전분해효소 유전자 크로닝 및 염기서열분석=69,96,1

1) 뽕나무버섯 균사체의 혈전분해효소 유전자 크로닝=69,96,3

2) 뽕나무버섯 균사체의 혈전분해효소 유전자 염기서열 분석=71,98,4

4. 적요=75,102,2

제3절 뽕나무버섯 균사체의 생리활성=77,104,1

1. 서론=77,104,4

2. 재료 및 방법=80,107,1

가.시료=80,107,2

나. 버섯추출물 조제=81,108,1

다. 실험동물=81,108,1

라. A. mellea 추출물의 투여=81,108,1

마. Rat tissue 로 부터 total RNA 분리=81,108,2

바. RT (reverse transcriptase)-PCR 및 specific primer=82,109,1

사. Immunohistochemistry=82,109,3

아. 다양한 배지조성물에 의한 뽕나무버섯의 항산화효과 검증=84,111,1

3. 결과 및 고찰=85,112,1

가. 신경영양인자 발현 유도 검증=85,112,1

1) Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)=85,112,2

2) Tyrosine-Hydroxylase gene(TH) 과 Glial DErived Neurotrophic Factor(GDNF)=86,113,7

3) 면역조직화학적 방법에 의한 TH의 발현 분석=92,119,5

나. 다양한 배지 조성물에 의한 항산화 효과=97,124,2

4. 적요=99,126,2

제4절 뽕나무버섯균의 영양요구성, 대량생산 및 가공식품개발=101,128,1

1. 서론=101,128,5

2. 재료 및 방법=106,133,1

가. 공시균주=106,133,1

나. 합성배지를 이용한 균사체 생산=106,133,1

1) 배지의 조제=106,133,1

가) 종배양용 배지=106,133,1

나) 배양용 배지=106,133,1

(1) 탄소원=106,133,1

(2) 질소원=106,133,2

(3) KH₂PO₄=107,134,1

(4) MgSO₄=107,134,1

(5) 기타 무기염류의 영향=107,134,1

(6) Vitamin=107,134,1

2) 배양방법=107,134,2

다. 천연배지를 이용한 균사체 생산=108,135,1

1) 배지의 조제=108,135,1

2) 접종원의 조제=108,135,2

3) 천연물 및 무기물의 첨가=110,137,1

4) 균사체 생산 최적화=110,137,1

5) 균사체의 성분분석=110,137,1

가) 일반성분=110,137,1

나) Vitamin D 정량=110,137,4

라. 혈전용해활성 측정=114,141,1

1) 조효소 분리 및 정량=114,141,1

2) 단백질 분해활성=114,141,1

3) 혈전용해효소 활성=114,141,2

마. 데이터 분석=115,142,1

3. 결과 및 고찰=115,142,1

가. 합성배지 상에서의 영양요구성=115,142,1

1) 탄소원의 영향=115,142,2

2) Glucose 농도의 영향=116,143,1

3) 질소원의 영향=116,143,3

4) Proteose peptone 농도의 영향=119,146,1

5) 무기염류의 영향=119,146,1

가) KH₂PO₄ 농도=119,146,1

나) MgSO₄농도=119,146,4

다) Cacl₂농도=122,149,1

라) 기타 무기염류=122,149,1

7) 비타민의 영향=122,149,5

나. 천연성배지를 이용한 균사체 생산=126,153,1

1) 최적배지선정=126,153,5

2) 균사체 생산배지 최적화=130,157,3

3) 천연물 추출물이 균사체 생산에 미치는 영향=132,159,8

다. 천연물 추출물이 혈전용해활성에 미치는 영향=139,166,5

라. 균사체의 성분=144,171,1

1) 일반성분=144,171,1

2) 비타민 D=144,171,3

마. 뽕나무버섯 균사체를 이용한 기능성 식품 개발=146,173,1

1) 원료=147,174,1

2) 제품 배합비=147,174,1

3) 제조 공정도=148,175,1

4. 적요=149,176,1

가. 합성배지를 이용한 뽕나무버섯 균사속 생산=149,176,1

나. 반합성배지와 천연배지를 이용한 균사속의 생산=149,176,1

다. 염가 천연배지 상에서의 균사체 대량생산 조건=149,176,2

라. 뽕나무버섯 균사체의 혈전용해활성=150,177,1

마. 뽕나무버섯 균사체의 영양성분=150,177,1

바. 뽕나무버섯 균사체를 이용한 기능성 식품개발=150,177,1

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도=151,178,1

제1절 목표달성도=151,178,1

1. 1년차 "고기능성 유용균주를 선별하여 혈전분해물질과 생리활성물질 탐색 및 분리"=151,178,1

가. 주관연구기관 조선대학교=151,178,1

1) 연구개발목표:혈전분해물질과 생리활성물질 탐색=151,178,1

2) 연구개발 내용 및 달성도=151,178,1

가) 버섯으로부터 신경성장인자 및 생리활성의 탐색=151,178,2

나) 혈전분해효소의 분리 및 특성 분석=152,179,1

다) 혈전분해효소 유전자의 탐색=152,179,2

나. 협동연구기관 익산대학교=153,180,1

1) 연구목표:고기능성 유용균주 선발 및 균주별 영양조건 확립=153,180,1

2) 연구개발 내용 및 달성도=153,180,1

가) 고기능성 유용균주선발=153,180,1

나) 균주별 영양조건 확립=153,180,1

2. 2년차 "혈전분해효의 대량생산과 실용화 기술개발"=154,181,1

가. 주관연구기관 조선대학교=154,181,1

1) 연구개발목표:혈전분해효소 유전자의 크로닝 및 대량생산과 제품화가능성=154,181,1

2) 연구개발 내용 및 달성도=154,181,1

가) 뽕나무버섯으로부터 혈전분해효소 유전자의 크로닝=154,181,1

나) 혈전분해효소의 상품화 가능성=154,181,1

나. 협동구기관 국립익산대학=154,181,1

1) 연구개발목표:혈전분해능 우수균 선발 및 버섯균 대량생산 체계화와 실용화 기술개발=154,181,1

2) 연구개발 내용 및 달성도=155,182,1

가) 혈전용해능 우수균 선발 버섯균=155,182,1

나) 버섯균 대량생산 체계확립 및 실용화 기술개발=155,182,1

다) 대량생산방법에 대한 특허출원=155,182,1

제5장 연구개발결과의 활용계획=156,183,1

제1절 제품화 개요=156,183,1

1. 제품화 기술의 중요성(필요성)=156,183,1

2. 혈전분해제 시장규모=157,184,1

3. 제품화 개발 시 예상되는 기대효과=157,184,3

제2절 제품화 목표 및 내용=159,186,1

1. 제품화 목표=159,186,1

2. 제품화 내용 및 범위=159,186,1

3. 기대효과=159,186,2

4. 제품화 후 활용방안 및 사업화 추진계획=160,187,1

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보=161,188,1

제1절 관련기술의 국내외 시장현황 및 사업화 전망=161,188,1

1. 국내외 연구현황=161,188,1

가. 국외 연구현황=161,188,2

나. 국내 연구현황=162,189,2

다. 문제점=163,190,2

제7장 참고문헌=165,192,16

영문목차

[title page etc.]=0,1,2

Summary in Korea=i,3,7

Summary in English=viii,10,7

Contents in English=xv,17,6

List of Table=xxi,23,2

List of Figures=xxiii,25,3

Contents in Korean=1,28,9

Chapter 1. Outline of Research Development=10,37,1

Section 1. The Aim and Necessity of Research Development=10,37,3

Section 2. The Aim of Research Development=12,39,2

Chapter 2. Present condition of Technology Development in Abroad and Domestic=14,41,1

Section 1. Situation of World market=14,41,1

Section 2. Research Situation=14,41,3

Chapter 3. Results and Contents of Research Development=17,44,1

Section 1. Screening of mushroom sources having fibrinolysis activity=17,44,1

1. Introduction=17,44,3

2. Materials and methods=19,46,1

A. Mushrooms sources=19,46,2

B. Liquid cultivation=20,47,1

C. Extraction of crude enzyme=20,47,1

D. Fibrinolytic activity measurement=21,48,1

3. Results and Discussion=21,48,1

A. The screening of fibrinolytic activity from media=21,48,2

B. The screening of fibrinolytic activity from mycelia=22,49,1

C. The screening of fibrinolytic activity from fruit bodies=22,49,2

D. Mycelial productivity of selected mushroom having functional activity=23,50,1

E. Economic benefits of the mycelial uses=23,50,7

4. Conclusion=30,57,1

Section 2. Purification and Characterization of fibrinolytic enzyme from Armillaria mellea mycelium=31,58,1

1. Introduction=31,58,4

2. Materials and Methods=34,61,1

A. Screening of Proteolysis and Fibrinolysis activity from .A. mellea mycelium=34,61,2

B. Purification and Characteriztion of fibrinolytic enzyme from .A. mellea mycelium=35,62,1

1) Sample=35,62,1

2) Coprotein extraction=35,62,2

3) Quantity of protein=36,63,1

4) Protein Purification=36,63,1

A) ion-exchange chromatogThy=36,63,1

(1) Cation-exchange column chromatography=36,63,1

(2) Anion-exchange column chromatography=36,63,2

B) Gel filtration=37,64,1

5) Collection of active fraction=37,64,1

6) Measurement of Fibrinolytic activity=37,64,2

7) Determination of molecular mass of fibrinolytic enzyme=38,65,1

A) SDS-PAGE=38,65,1

B) Fibrin-zymography=38,65,2

8) N-terminal sequence analysis=39,66,1

9) Analysis of fibrinolysis In vitro and in vivo=39,66,1

A) Effects of fibrinolysis In vitro=39,66,1

B) Effects of fibrinolysis In vivo=39,66,2

10) Characterization of purified fibrinolytic enzyme=40,67,1

A) Effects of fibrinolytic activity on metal ions=40,67,1

B) Effects of fibrinolytic activity on pH=40,67,1

C) Effects of fibrinolytic activity on temperature=41,68,1

D) Analysis of amidolytic activity on chromogenic substrate=41,68,1

E) Analysis of fibrinolysis and fibrinogenolysis=41,68,1

C. Molecular cloning of fibrinolytic enzyme gene in .A. mellea mycelium=41,68,1

1) Samlpe=41,68,2

2) Total RNA 분리=43,70,1

3) RT(Reverse Transcriptase)-PCR=43,70,1

4) Design of specific primer for molecular coining=43,70,1

5) Screening of fibrinolytic enzyme gene in A. mellea mycelium=43,70,2

D. Molecular cloning of fibrinolytic enzyme gene=44,71,3

E. DNA sequence analysis=46,73,2

3. Results and Discussion=48,75,1

A. Proteolytic and Fibrinolytic activity of A. mellea mycelium=48,75,1

1) Proteolytic activity of A. mellea mycelium=48,75,1

2) Screening of fibrinolytic activity of A. mellea mycelium=48,75,4

B. Protein concentration and purification from A. mellea mycelium=52,79,1

1) Coprotein concentration using Ethanol precipitation=52,79,1

2) Purification of fibrinolytic enzyme from A. mellea mycelium=52,79,8

C. Characterization of purified fibrinolytic enzyme=59,86,1

1) Measurement of fibrinolytic enzyme molecular mass=59,86,2

2) Effects of fibrinolytic activity in vitro and in vivo=60,87,2

3) Measurement of fibrinolytic activity on metal ions and protease inhibitors=61,88,1

4) Measurement of fibrinolytic activity on pH and temperature=61,88,3

5) Analysis of amidolytic activity on chromogenic substrats=63,90,1

6) Analysis of Fibrinolysis and fibrinogenolysis on SDS-PAGE=63,90,1

A) Fibrinolytic characterization of purified enzyme=63,90,7

B) Fibrinogenolytic characterization of purified enzyme=69,96,1

D. Molecular cloning and DNA sequence analysis of fibrinolytic enzyme gene in A. mellea mycelium=69,96,1

1) Molecular cloning of fibrinolytic enzyme gene in A. mellea mycleium=69,96,3

2) DNA sequencing analysis of fibrinolytic enzyme gene=71,98,4

4. Conclusion=75,102,2

Section 3. physiological activity of A. mellea mycelium=77,104,1

1. Introduction=77,104,4

2. Material and Methods=80,107,1

A. Sample=80,107,2

B. Extraction of A. mellea mycelium=81,108,1

C. Experimental animals=81,108,1

D. Treatment of A. mellea uteffeo extracts=81,108,1

E. Isolation of Total RNA from Rat tissue=81,108,2

F. RT (Reverse transcriptase)-PCR 및 specific primer=82,109,1

G. Immunohistochentstry=82,109,3

H. Antioxyident activity of A. mellea mycelium=84,111,1

3. Results and Discussion=85,112,1

A. Induction of Neurotrophic factor mRNA=85,112,1

1) Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)=85,112,2

2) Tyrosine-Hydroxylase gene(TH) and Glial DErived Neurotrophic Factor(GDNF)=86,113,7

3) Immunohistochemical analysis of iryrosine-Hydroxylase gene expression=92,119,5

B. Antioxident activity of A. mellea mycelium=97,124,2

4. Conclusion=99,126,2

Section 4. Growth optimization of A. mellea for mycelial production and development of processed foods using its mycelial mass=101,128,1

1. Introduction=101,128,5

2. Materials and methods=106,133,1

A. Mushrooms strain=106,133,1

B. Mycelial production in synthetic media=106,133,3

C. Mycelial production in natural media=108,135,6

D. Fibrinolytic activity measurement=114,141,2

E. Statistical analysis of data=115,142,1

3. Results and Discussion=115,142,1

A. Nutritional requirement in synthetic media=115,142,12

B. Mycelial production from natural media=126,153,14

C. Proteolytic and fibrinolytic activity from extract=139,166,5

D. Component of mycelium=144,171,3

E. Development of functional foods using Armillaria mellea=146,173,3

4. Conclusion=149,176,2

Chapter 4. Achievement of aim and Contribution of related region=151,178,5

Chapter 5. Plan of Practical Production=156,183,5

Chapter 6. Collection of foreign science information during research development=161,188,4

Chapter 7. Reference=165,192,16

Table 1. Mycelial yields from artificial cultivation of mushroom in liquid media=28,55,1

Table 2. Chrornogenic substrate=42,69,1

Table 3. Time course of fibrinolysis on human fibrin plate=51,78,1

Table 4. Purified fibrinolytic enzyme activity yields from A. mellea mycelium=55,82,1

Table 5. An aligment of the amino-terminal sequence of purified fibrinolytic enzyme of A. mellea mycelium with metalloendopeptidase of A. mellea fruiting body=57,84,1

Table 6. Effects of protease inhibitors on the activity of the fibrinolytic enzyme from A. mellea mycelium=64,91,1

Table 7. Effects of metal ions on the activity of the fibrinolytic enzyme from A. mellea mycelium=65,92,1

Table 8. Oligonucleotide primers for PCR used in this study=83,110,1

Table 9. List of culture media for production of mycelia of A. mellea=111,138,1

Table 10. List of plants and inorganic compounds added to GMEB=112,139,1

Table 11. Independent variables and the levels of variable chosen for trials=113,140,1

Table 12. HPLC condition for vitamin D2 analysis=113,140,1

Table 13. Effect of carbon sources on the rhizomorph growth of A. mellea=117,144,1

Table 14. Effect of concentration of glucose on the rhizomorph growth of A. mellea=118,145,1

Table 15. Effect of nitrogen sources on the rhizomorph growth of A. mellea=120,147,1

Table 16. Effect of proteose peptone concentration on the rhizomorph growth of A. mellea=121,148,1

Table 17. Effect of potassium phosphate monobasic concentrations on the rhizomorph growth of A. mellea=123,150,1

Table 18. Effect of magnesium sulfate concentrations on the rhizomorph growth of A. mellea=124,151,1

Table 19. Effect of calcium chloride concentrations on the rhizomorph growth of A. mellea=125,152,1

Table 20. Effect of minor mineral salts on the rhizomorph growth of A. mellea=127,154,1

Table 21. Effect of various vitamin source on the rhizomorph growth of A. mellea=128,155,1

Table 22. The equation by RSM pregram for DCW of A. mellea on various GMEB concentration=134,161,1

Table 23. The erluation by RSM program for DCW of A. mellea for the defined model in Table 11=136,163,1

Table 24. Predicted and experimental value of response suface for mycelial production of A. mellea at the defined condition in Table 11=137,164,1

Table 25. The effect of extract of plant and inorganic compounds, added to media on proteolytic activity of A. mellea=142,169,1

Table 26. Nutritional composition of A. mellea (mycelium)=145,172,1

Table 27. Vitamin D content of various mushroom sources=145,172,1