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목차

표제지=0,1,1

제출문=0,2,1

보고서 초록/이종교=i,3,1

요약문=ii,4,3

SUMMARY(영문요약문)=v,7,2

CONTENTS(영문목차)=vii,9,3

목차=x,12,5

제1장 연구개발과제의 개요=1,17,1

제1절 연구개발의 목적=1,17,1

제2절 연구개발의 필요성=1,17,2

제3절 연구개발의 범위=2,18,2

제2장 국내외 기술개발 현황=4,20,6

제3장 연구개발수행 내용 및 결과=10,26,1

제1절 연구내용=10,26,1

1. 시험관체계 연구=10,26,1

가. HSV-1 TK의 효소학적 연구=10,26,1

(1) TK 유전자 발현을 위한 HSV-1 돌연변이 TK유전자의 클로닝=10,26,1

(2) recTK 단백질의 분리=10,26,1

(3) 돌연변이 TK의 TMPK활성=10,26,1

(4) TK저해제 탐색=10,26,1

나. LAT 유전자의 클로닝 및 염기서열 결정=10,26,1

2. 세포체계 연구=10,26,1

가. 세포체계 잠복감염 및 재활성 모델=11,27,1

(1) 마우스 일차 신경세포 배양=11,27,1

(2) 신경세포의 바이러스 잠복감염 유도 및 확인=11,27,1

(3) 잠복감염된 신경세포로부터 재활성 유도 및 확인=11,27,1

(4) 돌연변이주들의 잠복감염력 및 재활성력 비교=11,27,1

나. TK와 세포내 물질의 상호작용 연구=11,27,2

(1) 세포 추출물의 2D 전기영동=12,28,1

(2) 세포내 thymidine 및 유도체 분석=12,28,1

(3) HSV-1의 cell tropism=12,28,1

(4) HSV 감염세포의 TK 단백질의 localization=12,28,1

3. 동물체계 연구=12,28,1

제2절 실험재료 및 방법=12,28,1

1. 실험재료=12,28,1

가. 세포=12,28,1

나. 바이러스=12,28,1

다. 박테리아=12,28,2

라. 시험동물=13,29,1

마. plasmid DNA=13,29,1

바. 시험약물=13,29,1

2. 실험방법=13,29,1

가. 세포주배양=13,29,1

나. 마우스 신경세포의 일차배양=14,30,1

다. 바이러스의 증식=14,30,1

라. 바이러스 역가측정=14,30,1

마. 항바이러스약효검색=14,30,2

바. 세포독성 검색=15,31,1

사. MTT검색법=15,31,2

아. 단백질정량=16,32,1

자. SDS／polyacrylamide 전기영동=16,32,1

차. 단백질 염색=16,32,2

카. TK 단백질의 Western 분석=17,33,1

타. 대장균내 TK유전자 발현과 TK단백질 분리 정제=17,33,2

파. Thymidine kinase 활성측정=18,34,2

하. TMP kinase 활성측정=19,35,1

갸. 유전자 조작=19,35,1

냐. 바이러스 DNA분리=19,35,1

댜. 유전자의 PCR 증폭=20,36,1

랴. DNA 염기서열 결정=20,36,1

먀. Herpes simplex virus의 DNA 클로닝=20,36,1

뱌. 마우스 조직내 바이러스 유전자 검출=20,36,3

샤. 세포추출물의 이차원 전기영동=22,38,2

야. 바이러스 감염세포내 단백질의 radio-labeling=23,39,1

쟈. TK의 intracellular localization=23,39,2

챠. Herpes simplex virus의 동물피부감염모델=24,40,1

캬. Herpes simplex virus의 mouse비강감염 모델=24,40,1

탸. 마우스의 대뇌감염=24,40,1

제3절 연구결과=25,41,1

1. 시험관체계 연구=25,41,1

가. H5V-1 TK의 효소학적 연구=25,41,1

(1) TK 유전자 발현을 위한 HSV-1 돌연변이 TK 유전자의 클로닝=25,41,1

(2) recTK 단백질의 분리=25,41,4

(3) recTK의 TMPK활성=28,44,3

(4) TK저해제탐색=30,46,7

나. LAT 유전자의 클로닝 및 염기서열 결정=36,52,11

2. 세포체계 연구=47,63,1

가. 세포체계 잠복감염과 재활성 모델구축 및 활용=47,63,1

(1) 마우스 신경세포 배양=47,63,1

(2) PC-12 세포 배양=47,63,1

(3) 신경세포의 바이러스 잠복감염 유도 및 확인=47,63,8

(4) 잠복감염된 신경세포로부터 재활성 유도 및 확인=55,71,5

나. TK와 세포내 물질의 상호작용 연구=60,76,1

(1) HSV TK 단백질의 세포내 존재 위치=60,76,1

(2) HSV감염 후 세포내 TK의 발현조사=60,76,1

(3) 세포 추출물의 2D 전기영동=60,76,6

(4) 세포내 thymidine 및 유도체 분석=65,81,9

3. 동물체계 연구=74,90,1

가. 마우스 감염조직의 바이러스 역가=74,90,5

4. 결론=79,95,3

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도=82,98,1

(1) 연구개발의 최종목표=82,98,1

(2) 연차별 연구개발 목표 및 내용=82,98,4

제5장 연구개발결과의 활용계획=86,102,1

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보=87,103,1

제7장 참고문헌=88,104,14

영문목차

[title page etc.]=0,1,8

CONTENTS=vii,9,8

Chapter 1. Summary=1,17,1

Section 1. Objectives of the studies=1,17,1

Section 2. Necessity of the studies=1,17,2

Section 3. The scope of the studies=2,18,2

Chapter 2. States of Technical Developments=4,20,6

Chapter 3. Contents and Results of the Studies=10,26,1

Section 1. Contents of the studies=10,26,1

1. Studies in test tube=10,26,1

A. Enzymatic studies on HSV-1 TK=10,26,1

(1) Cloning of the HSV-1 TK genes for gene expression=10,26,1

(2) Isolation and purification of the recTK protein=10,26,1

(3) TMPK activity=10,26,1

(4) Search for TK inhibitors=10,26,1

B. Cloning and sequence analysis of the LAT gene=10,26,1

2. Cell-based studies=10,26,1

A. Establishement of latency and reactivation model of HSV-1 in cell culture system=11,27,1

(1) Mouse primary neuronal cell culture=11,27,1

(2) PC-12 cell culture=11,27,1

(3) Induction and confirmation of viral latency in neuronal cell culture=11,27,1

(4) Induction and reactivation of reaction from latently infected neuronal cells=11,27,1

B. Interaction of TK with cellular materials=11,27,2

(1) Expression of the TK gene in HSV-1-infected cells=12,28,1

(2) 2D gel electrophoresis of cell lysates=12,28,1

(3) Quantification of thymdine and it's metabolites in cells=12,28,1

(4) Cell tropism of HSV-1=12,28,1

3. Animal study=12,28,1

Section 2. Materials and Methods=12,28,1

1. Materials=12,28,1

A. Cells=12,28,1

B. Viruses=12,28,1

C. Bacteria=12,28,2

D. Animals=13,29,1

E. plasmid DNAs=13,29,1

F. Test reagents=13,29,1

2. Methods=13,29,1

A. Culture of cell lines=13,29,1

B. Primary culture of mouse neuronal cells=14,30,1

C. Virus amplification=14,30,1

D. Virus titration=14,30,1

E. Antiviral evaluation=14,30,2

F. Cytotoxicity assay=15,31,1

G. MTT assay=15,31,2

H. Protein assay=16,32,1

I. SDS/ polyacrylamide gel electrophoresis=16,32,1

J. Protein staining=16,32,2

K. Western analysis=17,33,1

L. Expression of the TK gene in E. coli and purification of the TK proteins=17,33,2

M. Assay for TK activity=18,34,2

N. Assay for TMPK activity=19,35,1

O. Gene manipulation=19,35,1

P. Isolation of the viral DNAs=19,35,1

Q. PCR amplification of DNAs=20,36,1

R. Analysis of DNA sequences=20,36,1

S. Cloning of the HSV-1 viral genes=20,36,1

T. Detection of the viral genes in tissues from the virus-infected mice=20,36,2

U. 2D gel electrophoresis=22,38,2

V. Radiolabeling of proteins in the virus-infected cells=23,39,1

W. TK의 intracellular localization=23,39,2

X. Mouse cutaneous infection model for HSV-1=24,40,1

Y. Mouse intranasal infection model for HSV-1=24,40,1

Z. ouse intracerebral infection model for HSV-1=24,40,1

Section 3. Results=25,41,1

1. Stuides in test tube=25,41,1

A. Enzymatic studies on HSV-1 TK=25,41,1

(A) Cloning of the HSV-1 TK genes for gene expresstion=25,41,1

(B) Isolation and purification of the recTK protein=25,41,4

(C) TMPK activity=28,44,3

(D) Search for TK inhibitors=30,46,7

B. Cloning and sequence analysis of the LAT gene=36,52,11

2. Cell-based studies=47,63,1

A. Establishement of latency and reactivation model of HSV-1 in cell culture system=47,63,1

(A) Mouse primary neuronal cell culture=47,63,1

(B) PC-12 cell culture=47,63,1

(C) Induction and confirmation of viral latency in neuronal cell culture=47,63,8

(D) Induction and reactivation of reaction froln latently infected neronal cells=55,71,5

B. Interaction of TK with cellular materiats=60,76,1

(A) Localization of the TK protiens in HSV-1 infected cells=60,76,1

(B) Expression of the TK gene in HSV-1-iHected cells=60,76,1

(C) 2D gel electrophoresis of cell lysates=60,76,6

(D) Quantification of thymdine and it's metabolites in cells=65,81,9

3. Animal study=74,90,1

A. Virus titers of the tissues of HSV-1 infected mice=74,90,8

Chapter 4. Achievement and contribution=82,98,1

Section 1. Achievement=82,98,1

Section 2. Contribution=82,98,4

Chapter 5. Future plans=86,102,1

Chapter 6. Foreign information in science and technology received through the studies=87,103,1

Chapter 7. References=88,104,14

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