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목차
표제지=0,1,1
제출문=1,2,1
최종보고서 초록/김성구=2,3,1
요약문=3,4,2
SUMMARY=5,6,1
CONTENTS=6,7,2
목차=8,9,2
제1장 연구개발과제의 개요=10,11,2
제2장 국내외 연구개발 현황=12,13,2
제3장 연구개발수행 내용 및 결과=14,15,1
1절. 연구개발 내용=14,15,2
2절. 연구개발 결과=15,16,1
1. 바이러스의 대량 배양 및 분리=15,16,1
1-1. 세포주 및 바이러스 배양=15,16,1
1-2. 바이러스의 분리 및 정제=15,16,1
2. HIRRV 5' terminus의 클로닝 및 염기서열 분석=16,17,1
2-1. HlRRV로부터 genomic RNA 추출=16,17,1
2-2. HIRRV S' 말단의 염기 서열 결정 및 분석=16,17,3
3. HIRRV glycoprotein(G) gene의 클로닝=18,19,1
3-1. Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)=18,19,1
3-2. PCR product의 클로닝=18,19,6
3-3. Competent cell의 준비=23,24,1
3-4. Transformation=23,24,2
3-5. 재조합 G protein 생산 균주의 구축 및 단백질 발현 확인=24,25,1
4. GST-fusion G protein의 대량 발현 및 정제 조건 최적화=24,25,1
4-1. Inclusion body 정제를 위한 E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG' lysis=24,25,5
4-2. E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG'의 flask culture 및 fermentation=28,29,1
4-2-1. E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG'의 배양 최적 조건 결정=28,29,1
4-2-2. 배지 중 탄소원으로서의 glucose 공급농도 결정=28,29,1
4-2-3. G protein 대량생산을 위한 E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG' fermentation=28,29,4
4-2-4. GST-G 발현을 위한 IPTG의 최적 투여 시기 결정=31,32,4
4-2-5. IPTG의 최적 투여 농도 결정=34,35,1
4-3. GST-G protein 정제 과정의 최적화=34,35,6
4-4. 발현된 GST-G protein의 항원성 검증=39,40,1
4-4-1. Polyclonal antibody의 합성=39,40,3
4-4-2. Western blot Analysis=41,42,1
5. DNA vaccine 발현 시스템의 개발=41,42,1
5-1. Virus 항원 유전자의 확보 및 클로닝=41,42,1
5-2. HlRRV N gene과 HIRRV G gene의 PCR=41,42,3
5-3. pGEM-T vector로 ligation=43,44,1
5-4. Transformation 및 selection=43,44,1
6. DNA vaccine의 제조 및 효과의 검증=43,44,1
6-1. DNA vaccine의 제조=43,44,1
6-1-1. pIRES2-EGFP vector를 이용한 DNA vaccine 제작=43,44,5
6-1-2. pc-DNA 3.1(+) vector를 이용한 DNA vaccine 개발=47,48,1
6-l-2-1. HIRRV N gene과 G gene의 PCR=47,48,7
6-1-2-2. pGEM-T vector 클로닝=53,54,1
6-1-2-3. pc-DNA 3.1(+) vector로 subcloning=53,54,1
6-1-2-4. pc-DNA 3.1(+) vector로 subcloning 및 DNA 분리=53,54,2
6-2. 제작된 DNA vaccine의 vaccination 효과 검증=54,55,1
6-2-1. Cell line에서의 transfection=54,55,6
6-2-2. Transfection 결과의 확인=59,60,1
6-2-2-1. pIRES2-EGFP-G를 transfection한 cell line의 western blot analysis=59,60,1
6-2-2-2. pcDNA-G를 transfection한 cell line의 western blot analysis=59,60,3
6-3. DNA vaccination=62,63,1
6-3-1. DNA vaccine의 injection=62,63,1
6-3-2. Mx gene expression의 확인=62,63,2
6-4. Challenge test=63,64,1
6-4-1. Virus challenge후 감염된 넙치에서 HIRRV를 RT-PCR로 확인=63,64,4
7. RSIV(Red sea bream iridovirus) 획득을 위한 세포주 배양=67,68,1
7-1. RSIV(Red sea bream iridovirus) 획득을 위한 GF-2 cell의 배양=67,68,1
7-1-1. 세포주 배양 조건의 조절=67,68,1
7-1-2. 배지 내 FBS 농도의 영향=67,68,1
7-1-3. GF-2 cell 성장의 현미경 관찰=67,68,4
7-2. RSIV(Red sea bream iridovirus) 획득을 위한 BF-2 cell의 배양=71,72,1
7-2-1. BF-2 cell의 배양 조건 조절 및 현미경 관찰=71,72,1
7-3. RSIV(Red sea bream iridovirus) samples=71,72,1
7-4. RSIV infection의 실시 및 확인=71,72,1
7-4-1. GF-2 cell line을 이용한 virus infection=71,72,1
7-4-2. BF-2 cell line을 이용한 virus infection=71,72,5
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도=76,77,1
제5장 연구개발결과의 활용계획=77,78,1
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보=78,79,1
제7장 참고문헌=79,80,1
영문목차
[title page etc.]=0,1,6
CONTENTS=6,7,4
Chapter 1. Introduction=10,11,2
Chapter 2. The present condition of this era=12,13,2
Chapter 3. Contents and Results=14,15,1
Paragraph 1. Contents of this study=14,15,2
Paragraph 2. Results=15,16,1
1. Mass production and separation of virus=15,16,1
1-1. Cell line and virus culture=15,16,1
1-2. Separation and purification of virus=15,16,1
2. Cloning and gene sequence analysis of HIRRV 5' terminus=16,17,1
2-1. Genomic RNA extraction from HIRRV=16,17,1
2-2. Determination and analysis of HIRRV 5' terminus gene sequence=16,17,3
3. Gene cloning oi HRRV nucleocapsid(N) and glycoprotein(G)=18,19,1
3-1. Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)=18,19,1
3-2. Cloning of PCR products=18,19,6
3-3. Preparation of competent cell=23,24,1
3-4. Transformation=23,24,2
3-5. Construction of fusion G protein producing strain and protein expression=24,25,1
4. Optimization of overexpression and purification condition of GST-G protein=24,25,1
4-1. E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG' lysis for inclusion body purification=24,25,5
4-2. Flask culture and fermentation of E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG'=28,29,1
4-2-1. Optimization of culture condition on E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG'=28,29,1
4-2-2. Determination of glucose concentration as C source=28,29,1
4-2-3. E. coli BL21(DE3)／pGEXHRG' fermentation for G Protein mass production=28,29,4
4-2-4. Optimization of IPTG injection time for GST-G expression=31,32,4
4-2-5. Determination of IPTG concentration for GST-G protein expression=34,35,1
4-3. Process optimization of GST-G protein purification=34,35,6
4-4. Antigenesity verification of GST-G protein=39,40,1
4-4-1. Synthesis of polyclonal antibody=39,40,3
4-4-2. Western blot Analysis=41,42,1
5. Development of DNA vaccine expression system=41,42,1
5-1. Cloning of viral antigen gene=41,42,1
5-2. PCR of HIRRV N and G gene=41,42,3
5-3. Ligation to pGEM-T vector=43,44,1
5-4. Transformation and selection=43,44,1
6. DNA vaccine development and verification=43,44,1
6-1. DNA vaccine development=43,44,1
6-1-1. DNA vaccine development using pIRES2-EGFP vector=43,44,5
6-1-2. DNA vaccine development using pc-DNA 3.1(+) vector=47,48,1
6-1-2-1. HIRRV G gene and N gene PCR=47,48,7
6-1-2-2. Cloning with pGEM-T vector=53,54,1
6-1-2-3. Subcloning to pc-DNA 3.1(+) vector=53,54,1
6-1-2-4. Subcloning to pc-DNA 3.1(+) vector and DNA purification=53,54,2
6-2. Vaccination effect verification of DNA vaccine=54,55,1
6-2-1. Virus transfection of cell line=54,55,6
6-2-2. Result of transfection=59,60,1
6-2-2-1. Western blot analysis of pIRES2-EGFP-G transfection=59,60,1
6-2-2-2. Western blot analysis of pcDNA-G transfection=59,60,3
6-3. DNA vaccination=62,63,1
6-3-1. DNA vaccine injection=62,63,1
6-3-2. Mx gene expression=62,63,2
6-4. Challenge test=63,64,1
6-4-1. RT~PCR of HIRRV after challenge test=63,64,4
7. Cell line culture for RSIV(Red sea bream iridovirus)=67,68,1
7-1. GF-2 cell culture for RSIV(Red sea bream iridovirus)=67,68,1
7-1-1. Regulation of cell line culture condition=67,68,1
7-1-2. Effect of FBS concentration on the medium=67,68,1
7-1-3. Microscopic analysis of GF-2 cell culture=67,68,4
7-2. BF-2 cell culture for RSIV(Red sea bream iridovirus)=71,72,1
7-2-1. Regulation and microscopic analysis of BF-2 cell culture=71,72,1
7-3. RSIV(Red sea bream iridovirus) samples=71,72,1
7-4. RSTV infection and microscopic analysis=71,72,1
7-4-1. RSIV infection to GF-2 cell=71,72,1
7-4-2. RSIV Infection to BF-2 cell=71,72,5
Chapter 4. Achievement of the goals of research and contribution to related field=76,77,1
Chapter 5. Plans of result application=77,78,1
Chapter 6. Scientific and technological information collected during this research=78,79,1
Chapter 7. References=79,80,1
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