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목차

표제지=0,1,1

제출문=1,2,1

보고서초록/우성식=2,3,1

요약문=3,4,6

SUMMARY=9,10,9

CONTENTS(영문목차)=18,19,2

목차=20,21,2

그림목차=22,23,4

표목차=26,27,1

제1장 연구개발과제의 개요=27,28,2

제2장 국내외 기술개발 현황=29,30,4

제3장 연구개발수행 내용 및 결과=33,34,1

제1절 연구개발 내용=33,34,1

1. 제 1차년도=33,34,1

2. 제 2차년도=33,34,1

3. 제 3차년도=33,34,2

제2절 연구개발 방법=34,35,1

1. 제 1차년도=34,35,2

2. 제 2차년도=35,36,3

3. 제 3차년도=37,38,2

제3절 연구개발 결과=39,40,1

1. 분획물 은행 개발=39,40,1

가. 초고속 고효율 표준 분획법을 이용한 분획물 개발=39,40,5

나. 분획물의 chemical fingerprinting data 수집=44,45,8

다. High throughput purification (HTP) 및 high throughput screening(HTS) 기술 적용,기능성 천연물 소재 개발=51,52,2

2. 천연물 DB 구축=52,53,1

가. 사업단 추출물 은행 D／B와 연계된 활용 D／B 구축=52,53,2

나. 자생식물의 기능성 관련 유용정보 추가 수집=53,54,2

3. 유전파 발현 분석을 이용한 초고속,고효율 유효성분 탐색 시스템 개발=54,55,1

가. 유전자 발현 분석을 이용한 유효성분 검정에 적합한 모델약리기작 및 질환 선발=54,55,3

나. 유전자 발현 분석을 이용한 유효성분 검정법 최적화=56,57,2

다. 모델약리기작 선정 및 유전자군을 이용한 DNA chip 제작=57,58,2

라. 유전자 발현 분석 이용 유초성분 검정을 위한 모델 약리기작선정=58,59,2

마. 힉액순환관련 유전자 발현분석을 이용한 유효성분 검색=59,60,3

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도=62,63,1

제1절 목표 달성도=62,63,1

1. 1차년도=62,63,1

2. 2차년도=63,64,1

3. 3차년도=64,65,1

제2절 관련분야 기여도=65,66,2

제5장 연구개발결과의 활용계획=67,68,1

제1절 추가 연구의 필요성=67,68,1

제2절 타 연구에의 응용=68,69,1

제3절 기업화 추진방안=69,70,1

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보=70,71,1

제7장 참고문헌=71,72,2

특정연구 개발 사업 연구결과 활용 계획서=73,74,1

[첨부 1] 연구결과 활용 계획서=74,75,5

[첨부 2] 기술요약서=79,80,73

영문목차

title page=0,1,1

Report=1,2,1

Report abstract=2,3,1

Summary in Korean=3,4,6

Summary in English=9,10,9

Contents in English=18,19,2

Contents in Korean=20,21,2

List of Figures=22,23,4

Llst of Tables=26,27,1

Chapter 1. Summary of the Research Project=27,28,2

Chapter 2. Current Status of the Technology Concerned in Domestic and Abroad Research=29,30,4

Chapter 3. Contents and Results of the Research=33,34,1

Paragraph 1. Research contents=33,34,1

1. First year=33,34,1

2. Second year=33,34,1

3. Third year=33,34,2

Paragraph 2. Research methods=34,35,1

1. First year=34,35,2

2. Second year=35,36,3

3. Third year=37,38,2

Paragraph 3. Research results=39,40,1

1. Development of plant fraction library=39,40,1

A. Development of high throughput purification system for the standardized plant extraction and fractionation=39,40,5

B. Development of chemical fingerprinting protocol for the characterization of chemical property of plant using mass spectrum=44,45,8

C. Application the utility of HTP and HTS system for the discovery of bioactive natural product source=51,52,2

2. Development of Korean Natural Product DB=52,53,1

A. Construct of DB linked with Korean Plant Extract Bank=52,53,2

B. Collection of functional information regarding native plants=53,54,2

3. Development of high throughput efficacy evaluation system using gene expression analysis=54,55,1

A. Selection of appropriate model disease system to be used for discovery process using gene expression=54,55,3

B. Optimization of experimental method for discovery of active ingredient using gene expression analysis=56,57,2

C. Selection of disease related gene using DNA chip technique=57,58,2

D. Establishment of model disease system for discovery of active ingredient using gene expression analysis=58,59,2

E. Discovery of plant sources containing blood circulation improvement of through gene expression,in vitro and ex-vivo=59,60,3

Chapter 4. Achievement of the Research and its Contribucon=62,63,1

1. Achievement rate=62,63,3

2. Contribution to the neighbouring field=65,66,2

Chapter 5. The Utilizing Plan of the Research=67,68,1

Paragraph 1. Necessity of additional research=67,68,1

Paragraph 2. The application of the research to other field=68,69,1

Paragraph 3. The plan for commercializing of the research=69,70,1

Chapter 6. Technology Informacon Got from Abroad for the Research=70,71,1

Chapter 7. References=71,72,2

The Proposal for the Utilizing the Research Results of Special Development Project=73,74,1

[Addition 1] The Proposal for the Utilizing the Research Results=74,75,5

[Addition 2] Summary of Technology=79,80,73

그림목차

그림 1. 초고속 HTP 표준 분획물 제조를 위하여 추출효율 및 속도를 고려하여 구성한 식물 시료 전처리 과정=84,85,1

그림 2. 천연물 유기용층의 초고속 자동 분획 과정=84,85,1

그림 3. 천연물 수용층의 초고속 자동 분획 과정=85,86,1

그림 4. 초고속 고효율 분획법과 유기용층 분별 추출법간의 분획 효율성 비교=86,87,1

그림 5. TLC분리 pattern 분석을 통한 표준 분획물의 분획 효율성 검토=87,88,1

그림 6. 유기용층,수용층 표준 추출물 제조 및 이력 관리=87,88,1

그림 7. 유기용층,수용층 표준 분획물 제조 및 이력 관리=88,89,1

그림 8. 용매 분별 추출뭍을 활용한 HTP 표준 분획물 제조에 따른 기대 화합물군의 분포=88,89,1

그림 9. MS ionization charge(positive,negative)와 대상물질이 포함하는 작용기(hydroxy,acid,amine)의 특성별 m／z 검출 효율=89,90,1

그림 10. Phytosterol (brassicasterol(1),cholestenone(2),Stigmasterol(3),beta-sitosterol(3))의 HTP 표준 분획물 분획시,각 well별 분획물의 CC／MS profile 검색을 통한 용출 극성도 확인=90,91,1

그림 11. Steroid (Estrone,cholesterol)의 HTP 표준 분획물 분획시,각 well별 분획물의 CC／MS profile 검색을 통한 용출 극성도 확인=91,92,1

그림 12. 인삼(Panax ginseng) 유기층의 HTP료준 분획물내 steroid 분획물 위치 확인 및 고농도 steroid 분획물의 CC／MS profile=92,93,1

그림 13. 식물 조추출물 (제비쑥 (1),개똥쑥 (2),구절초 (3))으로부터 steroids 고농축 분획물 제조에 적합한 분획 용매 선정을 위한 용출 용매 처리별 CC／MS profile 비교=93,94,1

그림 14. 식물 조추출물의 GC／MS profile 확보에 적합한 steroids 고롱축 분획물의 GC／MS 주입 농도 선정을 위한 용출 용매의 처리 농도별 GC／MS profile 비교=94,95,1

그림 15. 식물 특성별 steroids의 간접적인 함량 검색에 활용할 수 있는 내부 표준물질 선정을 위한 hyocarbon 10종 (C10 ~ C28)의 처리 농도 (100ppm (a),250ppm (b),500ppm (c))에 따른 GC／MS pofile 비교=95,96,1

그림 16. monoterpene 및 sesquiterpene 등의 저비점 화합물의 GC／MS profile 검색을 위해 적합한 GC oven 온도 조건 설정 (50℃(a),70℃(b),100℃(c),150℃(d))에 따른 total ion chromatogram 분리 pattern=96,97,1

그림 17. HIP 표준 분획물 제조시 검출되는 UV spectrum을 통한 mono 및 sesquiterpene 표준품의 분회물내 용출 위치 확인=97,98,1

그림 18. 식물 유기풍의 steroids 고농축 분획물내 저비점 화합물 포집 여부를 검색하기 위한 구절초와 포천 구절초의 GC／MS의 TIC profile 검색=97,98,1

그림 19. Triterpenoids의 GC／MS 분석에 적합한 GC오븐의 최대 온도 영역 검토=98,99,1

그림 20. HTP 표준 분획물 제조시 검출되는 UV specotrum을 통한 triterpenoids표준품의 분획물내 용출 위치 화인=99,100,1

그림 21. 구절초의 HTP 표준 분획물의 GC／MS profile 결과 예시=100,101,1

그림 22. HTP 교준 분획물내 ginsenosides의 분획 위치 확인 및 LC／MS를 활용한 ginsenosides profile 분석=101,102,1

그림 23. Ginsenosides의 fragmentation pattern 분석을 통한 화학구조 동정에 활용 할 수 있는 LC／MS／MS 기술 예시=102,103,1

그림 24. LC／MS를 활용한 phenolic compounds 분자량 분석법 활용,강황으로 부터 iNOS 활성 물질 추적 동정 예시=103,104,1

그림 25. LC／MS 및 LC／MS／MS를 활용한 alkaloids 분자량 분석법 활용,UG03011으로부터 AchE 활성 물질 추적 동정 예시=104,105,1

그림 26. GC／MS를 활용,steroids 물직군의 profiling 및 물질 구조 검색=105,106,1

그림 27. 천연물 유용 정보 D／B에 수록되어진 수집 식물종의 Steroids 물질군 chemical fingerprinting 정보 예시=105,106,1

그림 28. 약용식물 (토후박)의 predictive value 지표 선정을 위한 식물 수집지역 별 토후박 steroids 추출물의 GC／MS profile 비교=106,107,1

그림 29. 약용식물 후박나무의 약재 부위의 predictive value 지표 선정을 위한 후박나무 부위별 steroids 추출물간의 GC／MS profile 비교=106,107,1

그림 30. 한악재 토후박의 predictive value 지보 선정을 위한 후박나무 동속 식물 steroids 추출물간의 GC／MS profile 비교=107,108,1

그림 31. 천연물 원료 품질관리 기준 지표 선정을 위한 천연물 steroids 분획물의 profile 검색 및 선정 물질을 활용한 정량 분석 적용성 검토=107,108,1

그림 32. 천연물 DB 시스템 및 분석기기 통합 network 구성도=108,109,1

그림 33. 천연물 DB의 main view format=108,109,1

그림 34. 천연물 DB의 주요 구성 모듈=109,110,1

그림 35. 추출물의 기능성 된련 추가 정보=109,110,1

그림 36. chemical finger print DB=110,111,1

그림 37. THP-1 세포주에 대한 천연추출물의 세포독성분석=111,112,1

그림 38. Sup-T1 세포주에 대한 천연추출물의 세포독성분석=112,113,1

그림 39. THP-1 세포주에서 천연추출물의 농도별 유전자 발현 분석=113,114,1

그림 40. THP-1 세포주에 천연추출물(인삼,UG02001 유기용층)처리시 ELISA를 이용한 농도별 TNF-α 생성량 비교=114,115,1

그림 41. Suf-T1 세포주에서 천연추출물의 농도별 유전자 발현 분석=114,115,1

그림 42. Sup-T1 세포주에 천연추출물(UG02001 유기용층)처리시 ELISA를 이용한 농도별 CM-CSF 생성량 비교=115,116,1

그림 43. RAW264.7 세포주에 대한 천연추출물의 세포독성분석=115,116,1

그림 44. RAW264.7 세포주에서 천연추출물의 농도별 iNOS 유전자 발현 분석=116,117,1

그림 45. Enzymatic assay를 이용한 RAW264.7 세포주에서 천연추출물의 농도별 iNOS 활성 억제효과의 분석=116,117,1

그림 46. RAW264.7 세포주에서 천연추출물의 농도별 COX-2 유전자 발현 분석=117,118,1

그림 47. RAW264.7 세포주에서 천연추출물의 ELISA를 이용한 농도별 COX-2 활성억제 효과=117,118,1

그림 48. RAW264.7 세포주에서 천연추출물의 농도별 Phospholipase A2 유전자 발현 분석=118,119,1

그림 49. BAEC 세포주에 대한 천연추출물의 세포독성분석 (UG02001 A:열수추출물 UG02001 B:수추출물)=118,119,1

그림 50. BAEC 세포주에 천연추출물 처리시 농도 및 시간별 세포활성분석=119,120,1

그림 51. HUVEC 세포주에서 천연추출물의 유전자(VEGF,eNOS) 발현분석=120,121,1

그림 52. Enzymatic assay를 이용한 eNOS 유전자 발현 재검증=121,122,1

그림 53. HUVEC cell을 이용한 in vitro wounding migracon assay에 의한 활성 재검증=121,122,1

그림 54. HUVEC cell을 이용한 in vitro tube formation assay 에 의한 활성 재검증=122,123,1

그림 55. UG02001 B의 96well 분획물 plate에서 Nitrate assay를 이용한 활성분획물 탐색(D8)=122,123,1

그림 56. DNA chip data중 유효한 유전자를 도식화한 histogram=123,124,1

그림 57. LPS 처리 후 발현이 2배 이상 증가한 유전자들의 증감 비교=124,125,1

그림 58. E-selectin 유전자 발현 조건 설정=125,126,1

그림 59. ICAM-1 유전자 발현 조건 설정=125,126,1

그림 60. VCAM-1 유전자 발현 조건 설정=126,127,1

그림 61. μ-PA 유전자 발현 조건 설정=127,128,1

그림 62. MMP-1 유전자 발현 조건 설정=128,129,1

그림 63. PAI-1 유전자 발현 조건 설정=129,130,1

그림 64. 무처리군 대비 유전자 발현양상 비교=130,131,1

그림 65. LPS 대비 유전자 발현율 비교=130,131,1

그림 66. VEGF 발힐유도 활성분획 검색=131,132,1

그림 67. eNOS 발현유도 활성분획 검색=131,132,1

그림 68. p-selectin 발현억제 활성분획 검색=132,133,1

그림 69. VCAM-1 발현억제 활성분획 검색=132,133,1

그림 70. PAI-1 발현억제 활성분획 검색=133,134,1

그림 71. PGI2 발현유도 활성분획 검색=133,134,1

그림 72. μ-PA 발현유도 활성분획 검색=134,135,1

그림 73. TNF-a 활성분획 검증=134,135,1

그림 74. 생리활성검정법(ELISA)을 이용한 RAW264.7 세포주에서 TNF-a 생성 억제효과 분석=135,136,1

그림 75. 생리활성검정법(ELISA)을 이용한 RAW264.7 세포주에서 IL-1a 생성 억제효과 분석=135,136,1

그림 76. 생리활성검정법(ELISA)을 이용한 HUVECs 세포주에서 E-selectin 생성 억제효과 분석=136,137,1

그림 77. 생리활성검정법(ELISA)을 이용한 HUVECs 세포주에서 ICAM-1 생성억제효과 분석=136,137,1

그림 78. 생리활성검정법(ELISA)을 이용한 HUVECs 세포주에서 VCAM-1 생성 억제효과 분석=137,138,1

그림 79. 생리활성검정법(ELISA)을 이용한 THP-1 세포주에서 MMP-1 생성 억제효과 분석=137,138,1

그림 80. 생리활성검정법(ELISA)을 이용한 THP-1 세포주에서 PAI-1 생성 억제효과 분석=138,139,1

그림 81. 생리활성검정법(ELTSA)을 이용한 HUVECs 세포주에서 μ-PA 생성효과 분석=138,139,1

그림 82. 동맥경화 모델동물을 이용한 UG02001의 효능 검정=139,140,1

표목차

표 1. 세포주별 천연추출물 처리시 세포독성 및 세포주 특성비교=140,141,1

표 2. Experiment Design for DNA Chip=140,141,1

표 3. Quality & integrity of isolated RNA=141,142,1

표 4. Labeling Solutions=141,142,1

표 5. Reaction mixture=141,142,1

표 6. Solution for Reverse transcription=142,143,1

표 7. Hybridization buffer=142,143,1

표 8. Inflammatory signal (LPS)에 의해 발현되어진 유전자 (Known Genes)=143,144,3

표 9. Inflammatory signal (LPS)에 의해 발현되어진 유전자 (Unknown Genes)=145,146,1

표 10. 일증관련 원인 유전자 30종에 대한 효능 확인=146,147,2

표 11a. 현액순환관련 지표 유전자=148,149,1

표 11b. TNF-a에 대한 UG-BB2와 UG-BB1의 IC50(억제활성농도)=148,149,1

표 12a. 세포주별 발현유도 유전자 및 Stimulator=149,150,1

표 12b. ICAM-1에 대한 UG-BB2와 UG-BB1의 C50(억제활성농도)=149,150,1

표 13a. RNA 추출 및 2-Step RT-PCR Protocol 확립=150,151,1

표 13b. E-selectin에 대한 UG-BB2와 UC-BB1의 IC50(억제활성농도)=150,151,1

표 14. VCAM-1에 대한 UG-BB2와 UG-BB1의 IC50(억제활성농도)=151,152,1

표 15. MMP-1에 대한 UG-BB2와 UG-BB1의 IC50(억제활성농도)=151,152,1

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