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목차

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제출문=0,2,1

목차=0,3,2

표목차=0,5,1

그림 목차=0,6,2

연구개발사업 최종보고서 요약문:초고속 무세포단백질합성 키트의 개발/강상현=1,8,1

Project Summary:Development of the rapid cell-free protein synthesis kit/Kang Sang Hyeon=2,9,1

총괄연구개발과제 연구결과=3,10,1

1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표=3,10,1

1.1. 연구의 배경=3,10,2

1.2. 연구의 최종 목표=4,11,2

1.3. 연구과제의 구성 및 추진체계=6,13,1

2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과=7,14,1

2.1. 무세포단백질합성 시스템의 최적화=7,14,1

2.1.1. 연구내용=7,14,2

2.1.2. 연구방법=8,15,3

2.1.3. 연구결과=11,18,1

1) DNA 농도에 따른 효과=11,18,1

2) Mg2+(이미지참조) 이온의 최적화=11,18,1

3) Extract의 종류의 영향=11,18,2

4) 온도의 영향=12,19,1

5) DTT의 영향=12,19,1

6) 외래 tRNA의 첨가 효과=12,19,12

2.2. Molecular chaperone을 이용한 단백질 folding 및 solubility 개선=24,31,1

2.2.1. 연구내용=24,31,1

2.2.2. 연구방법=24,31,1

1) 접힘관련 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 수용성 단백질 생산=24,31,3

2) 혼합세포배양법에 의한 접힘관련 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 수용성 단백질 생산=26,33,1

3) 각각 제조된 세포추출물의 혼합에 의한 수용성 단백질 생산=27,34,1

2.2.3. 연구결과=27,34,1

1) 접힘관련 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 수용성 단백질생산=27,34,2

2) 혼합세포배양법에 의한 접힘관련 인자가 포함된 세포추출물의 제조와 수용성 단백질 생산=28,35,2

3) 각각 제조된 세포추출물의 혼합에 의한 수용성 단백질 생산=29,36,6

2.3. Batch 및 Semi-continuous 반응기 비교 분석=35,42,1

2.3.1. 연구내용=35,42,1

2.3.2. 연구방법=35,42,2

2.3.3. 연구 결과=36,43,5

2.4. 무세포 발현용 벡터제작 및 생산단백질의 분리／정제=41,48,1

2.4.1. 연구내용=41,48,2

2.4.2. 연구방법=43,50,1

1) 발현 vector의 제작=43,50,1

2) 생산단백질의 분리／정제=44,51,4

2.4.3. 연구결과=48,55,14

2.5. 동결건조법의 적용=62,69,1

2.5.1. 연구내용 및 방법=62,69,3

2.5.2. 연구결과=65,72,6

2.6. 모델 유전자 발현 및 생산성 비교분석=71,78,1

2.6.1. 연구내용=71,78,1

2.6.2. 연구방법=71,78,1

2.6.3. 연구결과=71,78,4

2.7. 생산단백질의 활성 비교=75,82,1

2.7.1. 연구내용 및 방법=75,82,1

1) Chloramphenicol Acetyltransferase의 효소활성 분석=75,82,1

2) Enhanced Green Fluorescent Protein의 활성분석=76,83,1

2.7.2. 연구결과=77,84,1

1) Chloramphenicol Acetyltransferase의 효소활성 분석=77,84,1

2) Enhanced Green Fluorescent Protein의 활성분석=78,85,1

2.8. 다유전자의 동시발현 조사=79,86,1

2.8.1. 연구내용 및 방법=79,86,1

2.8.2. 연구결과=79,86,2

3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론=81,88,2

4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도=83,90,1

5. 총괄연구개발과제의 활용계획=84,91,3

6. 첨부서류=87,94,1

7. 참고문헌=88,95,1

표목차

Table 2.1.1. In vitro translation 반응에 요구되어지는 구성성분(according to the reaction step)=7,14,1

Table 2.1.2. Coupled transcription／translation reaction의 구성성분=9,16,1

Table 2.1.3. 단백질 생산에 미치는 S30A19와 S30BL21(DE3)의 효과 비교=19,26,1

Table 2.1.4. 온도에 따른 단백질 생산량 비교=21,28,1

1ab!e 2.3.1. 반연속공정 시스템용 5 * master mixture=36,43,1

Table 2.4.1. CAT의 염기서열=50,57,1

Table 2.4.2. Introducing sites의 염기서열=51,58,1

그림목차

Fig. 2.1.1. pK7-EPO DNA 농도의 최적화=13,20,1

Fig. 2.1.2. pK7-CAT DNA 농도의 최적화=14,21,1

Fig. 2.1.3. pK7-DHFR DNA 농도의 최적화=15,22,1

Fig. 2.1.4. pET21b-human AKT2 DNA 농도의 최적화=16,23,1

Fig. 2.1.5. pET21b-human beta- secretase DNA 농도의 최적화=17,24,1

fig. 2.1.6. Mg2+(이미지참조) 이온의 최적화=18,25,1

Fig. 2.1.7. S30A19와 S30BL21(DE3)의 단백질 생산량 비교=20,27,1

Fig. 2.1.8. 온도에 따른 단백질 생산량 비교=22,29,1

Fig. 2.1.9. tRNA 첨가여부에 따른 단백질 생산량 비교=23,30,1

Fig. 2.2.1. S30BL21,S30GroE1.S30GroE2의 활성비교(3hr)=31,38,1

Fig. 2.2.2. S30BL21,S30Dna1. S30Dna2의 활성비교(3hr)=31,38,1

Fig. 2.2.3. S30BL21,S30GroE1. S30GroE2의 활성비교(24hr)=32,39,1

Fig. 2.2.4. S30BL21,S30Dna1. S30Dna2의 활성비교(24시간)=32,39,1

Fig. 2.2.5. S30BL21,S30Hybrid GroE1-Dna1,S30Hybrid GroE2-Dna2의 활성비교(3hr)=33,40,1

Fig. 2.2.6. S30BL21,S30Hybrid GroE1-Dna1,S30Hybrid GroE2-Dna2의 활성비교(24hr)=33,40,1

Fig. 2.2.7. S30BL21,S30mixed GroE1-Dna1,S30mixed GroE2-Dna2의 활성비교(3hr)=34,41,1

Fig. 2.2.8. S30BL21,S30mixed GroE1-Dna1,S30mixed GroE2-Dna2의 활성비교(24hr)=34,41,1

Fig. 2.3.1. 30℃에서 batch와 semi-continuous 시스템의 단백질 생산량 비교=37,44,1

Fig. 2.3.2. 30℃에서 batch와 semi-continuous 시스템에서의 총생산단백질에 대한 수용성 단백질의 분율=38,45,1

Fig. 2.3.3. 37℃에서 batch와 semi-continuous 시스템의 단백질 생산량 비교=39,46,1

Fig. 2.3.4. 37℃에서 batch와 semi-continuous 시스템에서의 총생산단백질에 대한 수용성 단백질의 분율=40,47,1

Fig. 2.4.1. Histidine과 Imidazol의 화학적 구조=46,53,1

Fig. 2.4.2. NTA matrix와 Nickel 이온의 상호작용=46,53,1

Fig. 2.4.3. Ni-NTA matrix와 6 * His tag의 상호작용=47,54,1

Fig. 2.4.4. pK7-CAT의 유전자 지도=49,56,1

Fig. 2.4.5. pDIHXM 의 유전자 지도=52,59,1

Fig. 2.4.6. pD2HM의 유전자 지도=53,60,1

Fig. 2.4.7. pD3MH의 유전자 지도=54,61,1

Fig. 2.4.8. pD4M의 유전자 지도=55,62,1

Fig. 2.4.9. pD2HM-human AKT2의 유전자 지도=56,63,1

Fig. 2.4.10. pD2HM human beta- secretase의 유전자 지도=57,64,1

Fig. 2.4.11. human-AKT2를 포함하는 여러 vector들의 단백질 생산량 비교=58,65,1

Fig. 2.4.12. human beta-secretase를 포함하는 여러 vector들의 단백질 생산량 비교=59,66,1

Fig. 2.4.13. human AKT2분리=60,67,1

Fig. 2.4.14. human beta-secretase 분리=61,68,1

Fig. 2.5.1. 동결건조의 영향 I=67,74,1

Fig. 2.5.2. 보관온도별 단백질합성 활성비교 I=68,75,1

Fig. 2.5.3. 동결건조의 영향 II=69,76,1

Fig. 2.5.4. 보관온도별 단백질합성 활성비교 II=70,77,1

Fig. 2.6.1. CAT,EPO,EGFP의 발현=72,79,1

Fig. 2.6.2. beta-Galctosidase의 발현=73,80,1

Fig. 2.6.3. GroEL 발현=74,81,1

Fig. 2.7.1. 무세포단백질 발현 시스템에서 합성된 CAT의 효소적 활성=77,84,1

Fig. 2.7.2. 무세포단백질 발현 시스템에서 합성된 EGFP의 형광활성=78,85,1

Fig. 2.8.1. 세가지 단백질을 가지고 한 동시발현 조사=80,87,1

Fig. 5.1.1. 개발 전략 모식도=86,93,1

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