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목차

[표제지 등]=0,1,2

제출문=0,3,1

목차=1,4,3

제1세부과제명:버섯 바이러스의 분류체계 확립 및 전이 경로 구명=4,7,1

영문요약(Summary):=4,7,2

I. 서언=6,9,2

II. 연구사=8,11,3

III. 재료 및 방법=11,14,1

1. 사용균주 및 배양 조건=11,14,1

2. dsRNA 및 각 Segment 순수분리=11,14,2

3. 바이러스의 분리=12,15,2

4. 전자현미경 관찰=13,16,1

5. Poly(A)-Tailing에 의한 cDNA 합성=13,16,3

6. cDNA Cloning=15,18,1

7. 염기서열 및 아미노산 서열 분석=15,18,1

IV. 결과 및 고찰=16,19,1

1. 바이러스 및 dsRNA의 분리=16,19,6

2. cDNA 합성 및 Cloning=22,25,1

3. cDNA 염기서열 및 아미노산 서열 분석=23,26,4

4. 양송이에서 Viral dsRNA 분석결과=26,29,1

5. 바이러스 전이경로 구명=26,29,2

V. 적요=28,31,2

VI. 인용문헌=30,33,3

제2세부과제명:버섯바이러스의 진단용 특이 Primer 개발=33,36,1

영문요약(Summary)=33,36,2

I. 서언=35,38,1

II. 연구사=36,39,1

III. 재료 및 방법=37,40,1

1. 공시재료=37,40,1

2. 버섯바이러스 분리=37,40,1

3. 느타리버섯 바이러스의 게놈분석=37,40,1

4. 느타리버섯 바이러스의 진단에 특이적으로 이용될 수 있는 Primer 개발 및 실용성 조사=37,40,2

5. 신령 버섯과 느타리버섯 균주인 ASI2597, 부평복회에 감염된 바이러스의 게놈 염기서열 확인=38,41,1

6. 각 dsRNA 버섯바이러스의 특이적 진단에 이용될 수 있는 Primer 개발=39,42,1

IV. 결과 및 고찰=40,43,1

1. 느타리 및 신령버섯 바이러스의 게놈분석을 위한 cDNA Cloning 조건 확립=40,43,2

2. 느타리 및 신령버섯 바이러스 진단에 특이적으로 이용될 수 있는 진단법 개발=42,45,7

3. 느타리 바이러스 종류별 유전자 진단법 개선을 통한 정밀 진단 기술체계 확립=48,51,5

4. 신령 버섯과 느타리버섯 균주인 ASI2597, 부평복회에 감염된 바이러스 진단에 특이적으로 이용될 수 있는 진단법 개발=53,56,4

5. 정량적 성과=57,60,1

V. 적요=58,61,1

VI. 인용문헌=59,62,2

제3세부과제명:버섯 바이러스의 진단용 ELISA 키트 개발=61,64,1

영문요약 (Summary)=61,64,3

I. 서언=65,67,2

II. 연구사=67,69,3

III. 재료 및 방법=70,72,1

1. 새로운 느타리 dsRNA 바이러스(OMIV-III) 및 신령버섯 ssRNA 바이러스의 순수 분리 및 TAS-ELISA kit개발=70,72,8

2. 느타리버섯 바이러스, OMSV 및 GMSV-II Genome Nucleotide Sequencing 및 Genome Organization 구명=78,80,5

IV. 결과 및 고찰=83,85,1

1. 새로운 느타리 dsRNA 바이러스(OMIV-III)의 순수 분리 및 TAS-ELISA Kit개발=83,85,13

2. 느타리버섯 dsRNA 바이러스, OMSV-II RDRP Sequcncing 및 PCR용 특이 Primer 개발=95,97,19

3. 느타리버섯: ssRNA 바이러스, OMSV And Genome Organization=113,115,7

4. 신령버섯 바이러스 순수분리 및 진단 방법개발=119,121,7

V. 적요=126,128,2

VI. 인용문헌=128,130,6

칼라목차

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Figure 1: dsRNA And Electron Micrograph Of Virus Particles From Myoungwol=17,20,1

Figure 2: dsRNA And Electron Micrograpg Of Virus Particles From Sinnong-11. (A) Lanel: dsRNA; Lane2: dsRNA Treated With DNase I Lane3: Treated With S1 Nuclease; Lane4: dsRNA Extracted From Virus Particles. (B) Electron Micrograph Of Shinnong-11 Virus=18,21,1

Figure 3: dsRNA And Electron Micrograpg Of Virus Particles From Chiak-3. (A) Lanel: dsRNA; Lane2: dsRNA Treated With DNase I Lane3: Treated With S1 Nuclease; Lane4: dsRNA Extracted From Virus Particles. (B) Electron Micrograph Of Chiak-3 Virus=18,21,1

Figure 4: Electron Micrograph And dsRNA From Nonkong-98=19,22,1

Figure 5: dsRNA Analysis From Various Pleurotus spp. Viral dsRNAs Were Clearly Shown On Lane6(Baekdu) And Lane7(Samgu9). Lane1:Chiak3(Positive Control)=19,22,1

Figure 6: dsRNA From Baekdu And Samgu9 Were Treated With DNase I(Lane2) And S1 Nuclease(Lane3)=20,23,1

Figure 7: RT-PCR Analysis Of Samgu 9 Strain With Specific Primer. Lane1: Shinnong, Lane2: Myeongwol. Lane3: Chiak3=20,23,1

Figure 8: Band Pattern Of A. Blazei dsRNA And cDNA, Lane1: Lambda Hind III DNA Marker; Lane2: A. Blazei dsRNA; Lane3, 4: Sheared dsRNA; Lane 5, 6:cDNA Products From T-Vector=21,24,1

Figure 9: Sheared dsRNA And Poly (A) Tailing RT-PCR. Lane 1, 3, 5: Sheared dsRNA From Myoungwol, Shinnong-11 And Chiak-3; Lane 2, 4, 6: RT-PCR Product (A)-Tailed dsRNA From Same Strains=22,25,1

Figure 13: RT-PCR Using Specific Primer (A) Lane1: RT-PCR Product From Total dsRNA Of Myoungwol (B) Shinnong-11 Strain, Lane 1: cDNA Using Total dsRNA; Lane 2, 3: dsRNA Eluted From 8 And 2.5Kb Band=25,28,1

Figure 14: Amino Acid Sequence Alignment (A) Alignment Of The CP Of FpV1, PoV1 And cDNA From Myoungwol. (B) Alignment Of The RdRp Of HmPV1, RnPV1-W8 And cDNA From Shinnong-11. (C) Alignment Of The RdRp Of HmPV1, RnPV1-W8 And cDNA From Chiak-3=25,28,1

Figure 15: Nucleotide Sequence Of cDNA From Large dsRNA Segment Of Shinnong-11 And Sequence Comparison With Shinnong-8 And OMSV=26,29,1

Figure 16: dsRNA Analysis Of A. Bisporus Strain 6 Possible dsRNA From CF-11 Were Treated With S1 NUclease And DNase I. Only Lane 5(Strain #510) Shows 2 dsRNAs Resistant To Enzyme Treatment=26,29,1

그림 18. 분리한 신령(Lane 1), ASI2597(Lane 2), 부평복회(Lane 3)의 dsRNA를 Agarose Gel으로 전기영동한 사진. Lane M, Hide III로 전달한λ DNA Maker; Lane 4, ASI2596 dsRNA=38,41,1

그림 19. 대량배양된 균체에서 분리한 전체 RNA. 화살표는 dsRNA의 위치를 나타냄=40,43,1

그림 20. DNase 와 RNase A로 처리한 전체 RNA. Lanes 1-5: DNA Size Marker, ASI 2223, KMV001, KMV002와 KMV004=41,44,1

그림 21. Oligonucleotide Primer Ligation후 특이 Primer와 Random Primer를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR을 통하여 증폭한 DNA 절편들=41,44,1

그림 22. EcoRI 절단에 의한 삽입 DNA 확인=41,44,1

그림 7. 2596 검출용 특이 Primer로 PCR=48,51,1

그림 8. 수한 검출용 특이 Primer로 PCR=48,51,1

그림 12. ASI2223에 감염된 PoV1의 EM관찰 사진 및 바이러스에서 추출된 dsRNA=51,54,1

그림 13. 바이러스에 감염된 ASI2223에서 추출한 전체 RNA와 Viral dsRNA를 이용하여 각 dsRNA-1 및 dsRNA-2에 특이적인 프로브들을 이용하여 RNA Blotting을 수행함=51,54,1

그림 14. ASI2223, ASI2228 및 Suhan에서 순화된 dsRNA=52,55,1

그림 15. 특이 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과. 대상 dsRNA에서만 특이적인 DNA 절편이 대량으로 증폭됨을 확인하였음. 일부 프라이머 조합에서는 비특적인 DNA 증폭이 일어나는 것도 확인함=52,55,1

그림 18. PCR을 통해 얻은 각 DNA 단편을 Probe로 이용하여 Northern Blot을 수행한 결과. Lane M. Hide III로 절단한λ DNA Maker; Lane 1, 신령;Lane2, ASI2597;Lane3, 부평복회;Lane4, ASI2596=56,59,1

Fig. 3. Agarose Gel Electrophoresis Showing The Distribution Of The Viral Genome Following Equilibrium Centrifugation In 50% Cesium Chloride=86,88,1

Fig. 4. Ionic Strength-Dependant Sensitivity Of Purified Viral Nucleic Acids From Fraction Number 2,3 To Hydrolysis By Nuclease=87,89,1

Fig. 5. Nucleic Acids From Fraction 2 And 3 Were Amplified By RT-PCR Method With OMSV Genome-Specific Primers=87,89,2

Fig. 6. Ionic Strength-Dependant Sensitivity Of Purified Viral nucleic Acids To Hydrolysis By Nuclease=88,90,1

Fig. 7. Polypeptides Of Viral Coat Proteins In SDS-PaGE, Viral Coat Proteins Were Denatured For 5 Min At 95℃ In 50mM Tris-Clm pH 6.8, 1000mM Dithiothreitol, 2% SDS 10%glycerol, And 0.1% Bromophenol Blue. Denatured Proteins Were Separated By 12% Polyacrylamide Gel Electropgoresis. Gel Was Stained With Coomassie Brilliant Blue R-250. 1,2,3,4; Coat Proteins Of OMSV, OMIV-I, OMIV-II, OMIV-III, REspectively=90,92,1

Fig. 9. ELISA(A) And Western Blot Analysis(B) using Four Monoclonal Antibodies Against OMIV-III, Monoclonal Antibodies of Clone #4, #5, And #7 React With OMIV-III In Both ELISA ANd Western Bolt Analysis=92,94,1

Fig. 10. Titeration Of Polyclonal Antibody Against OMIV-III By ELISA. Rabbit Anti-Serum Was Diluted Initially By 50 Times And Subsequently By Two Times. Even 51200 Times Diluted Serum(←) Can Be Detected OMIV-III. NC;Negativ Control=92,94,1

Fig. 31. Possible Viral Disease Symptoms Of Agaricus Blazei=121,123,1

Fig. 33. Electron Micrograph Of Viruses Extracted From Diseased A. Blazei. The Size Of The Virus Is About 35nm. Stained With 2%(w/v) Aqueous Uranyl Acetate pG 4.5, Bar REpresent 230nm=122,124,1

Fig. 34. Genomic RNA Separation Of A.blazei Spherical Virus(AbSV). Virus Particles Of AbSV From Diseased A. blazei were Seqarated By Isopycnic Centrifugation In 1.585 g/cm³Cesium Chloride(CsCl) In Tris-EDTA Buffer. The Viral RNAs Were Extracted By Phenol, Precipitated With Ethanol, And Electrophoresed On 1% Agarose Gel. M; Size Makers Of ssRNA=122,124,1

Fig. 35. SDS PAGE Analysis Showing The Distribution Of The Viral Coat Protein Following equilibrium Centrifugation In 50% Cesium Chloride=123,125,1

Fig. 36. Ionic Strength-dependant Sensitivity Of Purified Viral Nucleic Acids To Gydrolysis By nyclease=123,125,1

Fig. 37. Agarose Gel Electrophoregram Of RT-PCR Product Of Agaricus Blazei Spherical Virus(AbSV) Genome using prSinRyung2 Primer=124,126,1

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