목차

[표제지]=0,1,1

제출문=1,2,2

보고서 초록=3,4,2

요약문=5,6,8

Summary(영문요약문)=13,14,6

Contents=19,20,4

목차=23,24,4

제1장 서론=27,28,4

제2장 국내ㆍ외 기술개발 현황=31,32,4

제3장 연구개발 수행 내용 및 결과=35,36,1

제1절 실험재료=35,36,1

1. 균주=35,36,1

2. 배지=35,36,1

3. Cell Lines 및 Media=35,36,2

4. Drugs=36,37,1

5. Oligonucleotide 합성 및 PCR(Polymerse Chain Reaction)=36,37,1

6. Reagents=36,37,1

7. 현미경=36,37,1

8. 제한효소=36,37,1

9. Filters=36,37,2

10. Sequencing=37,38,1

11. HTS(High Throughput Screening) System=37,38,1

12. Microplate Reader=37,38,1

13. DNA Chip=37,38,2

제2절 실험방법=39,40,1

1. 위암/간암 유전자 기능 연구를 위한 S. pombe 발현 연구=39,40,1

가. S. pombe Expression Vector의 Cateway 용 Destination Vector 제조=39,40,1

나. Human 유전자 cDNA의 S. pombe Expression Vector 클로닝=39,40,1

다. Human Gene의 S. pombe Overexpression=39,40,2

라. S. pombe Mutants를 이용한 항암제 민감성 관련 연구=40,41,2

2. Human 유전자의 암 관련성 검증=41,42,1

가. Cell Culture=41,42,1

나. Northern Blot 분석=41,42,1

다. RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)=41,42,2

라. Transfection=42,43,1

3. S. pombe의 Deletion Mutant를 이용한 대규모 약물 스크리닝=42,43,1

가. 384-well Liquid Assay=42,43,2

나. 384-well Plate Assay=43,44,1

다. 96-well Liquid Assay(IC50)(이미지참조)=43,44,2

라. 384 Robot Pinner를 이용한 약물 Plate Screen=44,45,1

4. S. Pombe의 Deletion Mutant를 이용한 약물의 표적 유전자 발굴=44,45,1

가. S. pombe merphology 변화와 Cell Staining=44,45,1

나. 다양한 Cancer Cell Line의 IC50 및 CI50조사=44,45,2

다. Flow Cytometry 분석=45,46,1

라. Apoptosis Assay=45,46,1

(1) Annexin V Assay=45,46,2

(2) Caspase 3 Assay=46,47,1

마. Xenograft Assay=46,47,1

바. 선도 물질의 화학 구조 유도체 합성=46,47,1

사. Human Microarray 분석=46,47,2

5. Tianscriptional silencing 조절하는 유전자 발굴 및 silencing 조절 약물 Screening=47,48,1

가. S. pombe Transformation=47,48,1

나. E. coli Transformation=47,48,2

다. Drug Screening 균주 제조 및 Silencing Assay=48,49,1

라. Genetic Screening 균주 제조 및 Liquid Assay=48,49,2

마. Functional Complementation=49,50,1

바. Drug Resistant Ts Mutant의 제조=49,50,2

제3절 결과 및 고찰=51,52,1

1. 위암/간암 유전자 기능 연구를 위한 S. pombe 발현 연구=51,52,1

가. 위암/간암 관련유전자의 고속 기능 검증 시스템 확립=51,52,1

나. Human gene의 S. pombe Overexpression 효과=51,52,2

다. S. pombe Mutants를 이용한 항암제 민감성 관련 연구=52,53,1

2. Human 유전자의 암관련성 검증=52,53,1

가. 유전자의 발현 연구=53,54,1

나. Northern blot 또는 RT-PCR에 의한 표적 유전자의 발현량 분석=53,54,1

다. Proliferation 분석=53,54,1

라. Foci Formation=53,54,2

3. S. pombe의 Deletion Mutant를 이용한 대규모 약물 스크리닝=54,55,1

가. 대규모 약물 스크리닝을 위한 Kit Strain의 선정=54,55,1

나. 대규모 약물 스크리닝=54,55,1

4. 후보 물질의 항암효과 연구=54,55,2

5. 후보 물질의 표적유전자 발굴=55,56,1

6. 후보 물질의 #4의 약물 작용기작 연구=55,56,1

7. 후보 물질의 KHG9의 작용 기작 연구=55,56,1

가. S. pombe Morphology 변화=55,56,1

나. S. pombe Mutant를 이용한 Target 조사=55,56,2

다. Apoptosis Assay=56,57,1

라. 다양한 Cancer Cell Line의 IC50 및 CI50조사(이미지참조)=56,57,1

마. Xenograft Assay=56,57,1

바. #9의 유도체 합성=56,57,1

사. Human Microarray 분석=56,57,2

8. 항암제 Cerulenin 작용 기작 연구=57,58,1

가. Cerulenin의 Cytotoxicity와 Adenine과의 관계=57,58,1

나. S. pombe Deletion Mutant를 이용한 Target 탐색=57,58,1

다. 세포 내 AMP/ATP 양의 비교=57,58,2

9. Transcriptional Silencing 조절 유전자 발굴 및 Genetic 스크리닝 시스템 확립=58,59,1

가. Heterochromatin 구조적 요인에 기인한 Transcriptional Silencing 조절 하는 스크리닝 시스템 개발을 위한 Strain 제조=58,59,1

나. S. pombe 돌연변이 균주와 Silencing Kit Strain을 이용한 Silencing 신규 조절 유전자 발굴=59,60,1

다. 발굴된 신규 돌연변이주와 분열효모 Library를 이용한 기능연구=59,60,1

10. NCI Library를 스크리닝을 통한 Chromatin 구조 및 Segregation 관련 항암 선도 물질을 발굴=59,60,1

가. Silencing과 관련된 Drug을 Screening 하기 위해서 관련 균주를 제조=59,60,2

11. 암관련 Human Gene을 타켓으로 하는 약물 발굴 시스템 확립=61,62,1

12. Database 구축=61,62,52

제4장 목표 달성도 및 대외기여도=113,114,6

제5장 연구개발 결과의 활용계획=119,120,1

제1절 타 연구에의 응용=119,120,2

제2절 사업화 및 기술이전=120,121,3

제6장 해외 과학기술 정보=123,124,1

제1절 Budding Yeast S. cerevisiae Deletion Mutant를 이용한 약물 스크리닝=123,124,2

제2절 S. cerevisiae에 Huamn Gene의 Overexpression에 의한 유전자 기능 연구 및 약물 스크리닝=124,125,2

제3절 S. pombe Deletion Mutant를 이용한 NCI Chemical Library 스크리닝을 통해 발굴된 KHG9의 작용기전 연구와 관련된 연구=125,126,2

제7장 참고문헌=127,128,3

영문목차

[title page etc.]=0,1,13

Summary=13,14,6

Contents=19,20,8

I. Introduction=27,28,8

II. Materials And Methods=35,36,1

1. Experimental Materials=35,36,1

(1) Strains=35,36,1

(2) Culture Media=35,36,1

(3) Cell Lines And Media=35,36,2

(4) Drugs=36,37,1

(5) Oligonucleotides And PCR=36,37,1

(6) Chemical Reagents=36,37,1

(7) Microscope=36,37,1

(8) Restriction Enzymes=36,37,1

(9) Filters=36,37,2

(10) Sequencing=37,38,1

(11) HTS(High Throughput Screening) System=37,38,1

(12) Microplate Reader=37,38,1

(13) DNA Chip=37,38,2

2. Experimental Procedures=39,40,1

(1) S. Pombe Expression Study For Functional Analysis Of The Human Genes Related To Gastric And Liver Cancer=39,40,1

① Construction Of Gateway Destination Vector For S. Pombe Expression Vector=39,40,1

② S. Pombe Expression Vector Cloning Of Human Gene cDNA=39,40,1

③ S. Pombe Overexpression Of Human Gene=39,40,2

④ Anticancer Drugs Sensitivity Using S. Pombe Mutants=40,41,2

(2) Validation Of Cancer Relation For Human Genes=41,42,1

① Cell Culture=41,42,1

② Northern Blotting=41,42,1

③ RT-PCR=41,42,2

④ Transfection=42,43,1

(3) Drug Screening Using S. Pombe Deletion Mutant=42,43,1

① 384-Well Liquid Assay=42,43,2

② 384-Well Plate Assay=43,44,1

③ 96-Well Liquid Assay(IC50)(이미지참조)=43,44,2

④ Drug Plate Screen Using 384 Robot Pinner=44,45,1

(4) Identification Of Drug Targets Using S. Pombe Deletion Mutant=44,45,1

① S. Pombe Morphology Change And Cell Staining=44,45,1

② IC50 Or GI50 Of Cancer Cell Line(이미지참조)=44,45,2

③ Flow Cytometry Analysis=45,46,1

④ Apoptosis Assay=45,46,1

ⓐ Annexin V Assay=45,46,2

ⓑ Caspase 3 Assay=46,47,1

⑤ Xenograft Assay=46,47,1

⑥ Structure Derivative Synthesis Of Leading Drugs=46,47,1

⑦ Human Microarray Analysis=46,47,2

(5) Screening Of Genes And Drugs Regulating Transcriptional Silencing=47,48,1

① S. Pombe Transformation=47,48,1

② E. Coli Transformation=47,48,2

③ Strain Construction For Drug Screening Or Silencing Assay=48,49,1

④ Strain Construction For Genetic Screening Or Liquid Assay=48,49,2

⑤ Functional Complementation=49,50,1

⑥ Construction Of Drug Resistant Ts Mutant=49,50,2

III. Results And Discussion=51,52,1

(1) S. Pombe Expression Study For Functional Analysis Of The Human Genes Related To Gastric And Liver Cancer=51,52,1

① Validation System Of Genes Function Related To Gastric And Liver Cancer=51,52,1

② S. Pombe Overexpression Effect Of Human Gene=51,52,2

③ Anticancer Drugs Sensitivity Using S. Pombe Mutants=52,53,1

(2) Validation Of Cancer Relation For Human Genes=52,53,1

① Expression Study Of Human Genes=53,54,1

② Expression Level Analysis Of Target Genes By Northern Blot Or RT-PCR=53,54,1

③ Proliferation Analysis=53,54,1

④ Foci Formation=53,54,2

(3) Drug Screening Using S. Pombe Deletion Mutant=54,55,1

① Kit Strain Selection For Drug Screening=54,55,1

② Drug Screening=54,55,1

(4) Anti-Cancer Effect Of Candidate Drugs=54,55,2

(5) Target Gene Validation Of Candidate Drugs=55,56,1

(6) Action Mechanism Study Of #4 Candidate Drug=55,56,1

(7) Action Mechanism Study Of KHG9 Candidate Drug=55,56,1

① S. Pombe Morphology Change=55,56,1

② Identification Of Drug Targets For S. Pombe Mutant=55,56,2

③ Apoptosis Assay=56,57,1

④ IC50 Or GI50 Of Cancer Cell Line(이미지참조)=56,57,1

⑤ Xenograft Assay=56,57,1

⑥ #9 Drug Derivative Synthesis=56,57,1

⑦ Human Microarray Analysis=56,57,2

(8) Action Mechanism Study Of Anticancer Drug, Cerulenin=57,58,1

① Relation Of Cytotoxicity And Adenine=57,58,1

② Identification Of Drug Targets For S. Pombe Mutant=57,58,1

③ Analysis Of AMP/ATP Level in vivo=57,58,2

(9) Transcriptional Silencing-regulating Gene Identification And Genetic Screening System=58,59,1

① Strain Construction For Silencing Assay=58,59,1

② New Silencing-regulating Gene Identification Using S. Pombe Mutant Strains And Silencing Kit Strain=59,60,1

③ Functional Study Using New Identified Strains And S. Pombe Library=59,60,1

(10) Validation Of Anti-cancer Leading Drug Related Chromatin Structure And Segregation Through NCI Library Screening=59,60,2

(11) Drug Validation System For Cancer-related Human Genes=61,62,1

(12) Database Construction=61,62,52

IV. Conclusion=113,114,14

V. References=127,128,3