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SUMMARY

목차

I. 서언 19

II. 재료 및 방법 23

1. 식물 재료 23

2. 유전자발현 프로파일 분석 (Microarray analysis) 23

3. RT-PCR에 의한 전사인자 유전자 분리 23

4. Real-time PCR 방법에 의한 유전자 발현분석 23

5. Micro RNA 발현 분석 (Northern 분석) 24

6. 단백질의 세포내 발현 위치 조사 (GFP 형광분석) 24

7. 식물발현 벡터 제작 24

8. 애기장대 형질전환체 생산 25

9. 벼 형질전환체 생산 25

III. 결과 및 고찰 26

[국내 - 농촌진흥청] 26

1. 벼 고분얼 돌연변이체의 특성 분석 26

2. 벼 고분얼 돌연변이체의 유전자 발현패턴 분석 및 주요 전사인자 탐색 27

3. 고분얼 돌연변이체의 주요 유전자 발현 분석 (Real-time PCR) 29

4. 벼 TCP 계열 전사인자의 구조 및 분자생물학적 특성 분석 32

5. 벼 TCP 전사인자의 유전자 발현양상 분석 34

6. 벼 TCP 전사인자 유전자 분리 및 단백질의 세포내 분포 조사 36

7. 벼 수발아 돌연변이체(viviparous mutant)의 특성 및 유전자 발현 분석 37

8. 완두 시토키닌 생합성 유전자(PsIPT2)가 도입된 형질전환체 생산 및 분석 40

[국외 - Nagoya University] 42

9. 완두 측아의 휴면성과 연관된 유전자 탐색 및 선발 42

10. 완두측아의 휴면재개와 연관된 유전자 발현 및 단백질 구조 분석 44

11. 완두 측아에서 cell cycle 유전자 발현 및 단백질 복합체 분석 48

12. 완두 cell cycle 조절 유전자 (KRP) 분리 및 분자생물학적 분석 52

13. 완두 정단우성에서 cell cycle에 의한 휴면 조절 모델 56

IV. 종합결과 57

[국내 - 농촌진흥청] 57

가. 벼 고분얼 돌연변이체의 유전자 발현패턴 분석 및 주요 전사인자 탐색 57

나. 유전자 발현 분석 57

다. TCP 전사인자 분리 및 분자생물학적 특성 분석 57

라. 완두 휴면조절유전자가 도입된 형질전환체 생산 58

마. 벼 Ds 삽입 돌연변이체 유전자 발현분석 및 유용 전사인자 유전자 선발 58

[국외 - Nagoya University] 58

가. 완두 측아의 휴면타파와 연관 유전자 탐색 및 선발 58

나. 유전자 발현 분석 58

다. 완두 측아에서 cell cycle 복합체 분석 58

라. 완두 KRP1 유전자 분리 및 분자생물학적 분석 58

V. 적요 59

VI. 인용문헌 62

I. 제목

벼 농업형질 개선을 위한 휴면조절 유전자 이용연구

II. 연구목적 및 중요성

종자와 측아의 휴면성은 작물의 농업생산성에 영향을 주는 매우 중요한 요인이다. 휴면성은 종자나 측아가 생존에 부적합한 환경조건에서 발아, 생장하지 않은 채 휴면 상태를 유지하여 생존력을 높이는 일종의 적응전략이라고 할 수 있다. 덕분에 식물은 혹한, 건조 등의 어려운 기간을 견디고, 좀 더 좋은 조건에서 생활사를 시작할 수 있게 된다. 종자의 경우 수확기 휴면성이 낮으면 고온 다습 조건에서 수발아를 유발하여 낱알의 품질이 저하되므로 큰 경제적 손실을 끼치게 된다. 벼, 밀, 옥수수 등 곡류의 종자가 수확기 이전에 이삭이 달린 채로 수분이 많은 조건에서 발아하는 현상을 수발아라고 하는데, 늦여름과 가을의 등숙기의 침수피해와 맞물려 미질과 수량을 크게 저하시키는 원인이 되고 있다. 중국 남부의 경우 기후에 따라서 재배면적의 6% 이상 수발아 피해를 입기도 하는데 이는 중국 내 hybrid rice의 약 20%에 해당하는 양이다. 국내에서도 중만생종을 중심으로 품종에 따라 해마다 수발아 피해가 발생하여 경제적 손실은 물론 공권력 투입이 필요한 사회적 문제가 되고 있어 조속한 해결이 필요한 농업현안문제가 되고 있다. 반면, 종자의 휴면성이 너무 강하면 발아를 촉진하기 위한 추가 비용과 노력이 요구된다. 또한 측아의 휴면성은 영양생장기와 생식생장기의 다양한 형태를 결정하게 되므로 식물의 생산구조를 변화시켜 농업생산성에 영향을 주는 주요 농업형질이다. 사실상 작물의 휴면성은 환경과 호르몬자극의 상호작용에 의해 세포의 발생과 생장이 조절되어 나타나는 매우 복잡한 농업형질로 알려져 있으나, 최근 모델 식물인 애기장대와 토마토, 벼, 옥수수 등 주요 작물에서 휴면성을 조절하는 분자유전학적 기작 및 원인 유전자가 밝혀지고 있는 단계에 있다.

본 국제공동 과제에서는 벼의 수발아, 분얼형성 등 휴면성을 조절하는 주요 유전자를 분리하고 분자생물학적 기능검정을 수행하여, 작물의 휴면형질개량에 이용할 수 있도록 제공하는데 목표를 두었다.

III. 연구내용 및 결과요약

1. 연구내용

본 과제의 연구목표는 작물의 휴면 조절에 이용 가능한 유전자를 탐색하고 분리하여 그 기능을 분석하는 것이다. 농촌진흥청에서는 벼의 분얼형성과 수발아 조절을 목적으로 고분얼 돌연변이체와 수발아 돌연변이체를 연구재료로 선발하고, DNA chip 분석을 통해 유전자 발현패턴을 분석하여 TCP 등 유용한 전사인자 유전자를 발굴, 분석하였다. 나고야대학에서는 원예작물의 곁가지 생성 조절을 목적으로 완두 측아의 휴면과 연관된 유전자 및 단백질을 탐색하여 cell cycle 조절 유전자를 발굴하였다. 또한 측아 휴면을 타파하는 호르몬으로 알려진 시토키닌 생합성 유전자를 도입한 형질전환 애기장대를 생산하여 곁가지 생성패턴이 변하였음을 증명하였다.

[국내 - 농촌진흥청]

벼의 휴면조절 유전자 분리를 위하여 종자 휴면성과 측아휴면성이 약화된 벼 수발아 돌연변이체와 고분얼 돌연변이체를 재료로 선발하였고, 각각 DNA chip 분석을 통해 주요 전사인자 유전자군의 발현 프로파일링을 분석하였다. 벼 고분얼 돌연변이체의 분열조직에서는 대조구에 비해 TCP domain을 포함하는 전사인자군과 bHLH 전사인자군의 유전자 발현이 높은 반면 Myb 계열, Ap2 계열, hox 계열 전사인자군의 발현이 억제되어 있음을 확인하였다. 그러나 수발아성 미성숙 종자의 배에서는 대조구에 비해 Myb 계열, Ein3 계열, WRKY 계열의 전사인자 유전자 발현이 증가한 반면, Zinc finger 계열, bHLH 계열, Nuclear factor Y 계열의 전사인자 발현이 크게 감소하였다. 이런 결과는 벼에서 종자의 휴면성과 측아의 휴면성을 조절하는 전사인자 유전자군이 뚜렷한 차이가 있음을 시사한다. 또한 고분얼 돌연변이체에서 cell cycle과 관련된 유전자군의 발현이 매우 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었는데 이런 결과는 분열조직의 세포분열활성과 분얼형성간에 연관성이 있음을 시사해준다. 한편 수발아 미성숙종자의 경우 LEA 유전자의 발현이 억제되어 있으며, 종자의 아밀라아제 활성이 ABA에 의해 억제되지 않는 것으로 보아 ABA 반응성이 약화되어 후기 종자발달과정이 불완전하여 휴면성이 낮아졌을 가능성이 있다고 사료된다.

벼의 TCP 계열 전사인자군은 약 26종이며 TCP domain 구조에 따라 5-6개의 subgroup으로 분류된다. 본 과제에서 선발된 TCP 계열 전사인자의 5종의 유전자 발현 양상을 분석한 결과는 shoot와 분열조직에서 발현수준이 높다는 것을 보여준다. 특히 TCP6의 경우 줄기와 분열조직에서 cytokinin인 BA 처리에 의해 유전자 발현이 유도 되는 경향을 보이므로 TCP6가 시토키닌에 의한 줄기분화에 특정 기능을 담당할 가능성이 있다. 본 과제에서 TCP 전사인자 유전자를 클로닝하여 핵에서 발현되는 단백질임을 확인하였다. 또한 TCP5, TCP6, TCP7의 경우 유전자내에 miR319의 target 유사서열이 존재하는 것이 확인되었다. 따라서 고분얼 돌연변이체에서 miR319에 의해 TCP 계열 전사인자들의 유전자 발현이 조절될 가능성을 조사하였으나 고분얼 돌연변이체에서 오히려 miR319a 발현수준이 더 높다는 것을 확인하였다. 이런 결과는 TCP 전사인자 유전자군의 발현증가가 miR319에 기인한 것이 아님을 시사한다. 그러나 miR319가 벼 분얼형성에 어떤 특이적인 기능을 수행하는지에 대한 향후 연구가 필요하다.

[국외 - Nagoya University]

본 과제의 국제공동연구자인 일본 나고야대학에서는 완두의 측아휴면을 조절하는 유전자를 분리하고 기능을 분석하는 연구를 수행하였다. Differential cDNA library 분석과 macroarray 분석을 통해 완두 측아의 휴면이 타파되거나, 재개될 때 차등 발현되는 유전자군을 선발하였다. AD1, lipoxygenase, FAD binding domain containing protein 유전자는 생장하는 main bud에서는 발현되지 않으나 휴면이 재개되는 accessory bud에서 유전자 발현이 급증하므로 휴면을 유지하는 기능이 있을 것으로 추정된다. 특히 FAD binding domain containing protein 유전자의 경우 완두 측아에서 특이적으로 발현되는 것을 확인하였으므로 측아휴면을 조절하는 특이기능을 수행할 가능성이 크다고 할 수 있다.

완두 측아의 휴면이 타파되어 생장이 재개될 때 세포분열 활성이 증가한다. Cell cycle 관련 유전자군의 발현을 분석한 결과 휴면상태의 완두측아 세포가 G1 단계에서 멈추어 있음을 확인하였다. 측아의 휴면을 조절하는 cell cycle regulator를 발굴하기 위해 PCNA 단백질 복합체를 분리하거나, inhibitor 유전자를 분리하는 연구를 수행하였다. PCNA 항체컬럼을 이용하여 휴면상태의 측아에서 분리한 단백질로부터 PCNA와 결합하는 단백질 복합체를 분리하고 펩타이드를 분석하였으나 주 단백질로 PCNA가 검출되었으며 다른 단백질의 경우 농도가 낮아서 측정이 어려웠다. 한편 cell cycle을 조절하는 주요단백질인 cyclin dependent kinase의 inhibitor로 알려진 KRP(Kip-related protein) 유전자를 완두에서 클로닝하고 E. coli에서 재조합단백질을 생산하여 polyclonal antibody를 제작하였다. PsKRP1이 완두측아의 휴면과 연관되어 있는지를 조사하기 위하여 유전자 및 단백질 발현을 분석한 결과 PsKRP1 단백질이 휴면 상태의 측아에서 발현양이 높은 반면 정단아 제거후 생장이 재개되는 측아에서는 발현양이 크게 감소한다는 것을 규명하였다. 이런 결과는 KRP1이 측아의 생장재개와 관련된 cell cycle을 조절하는 주요인자임을 시사한다.

측아의 휴면조절은 호르몬인 옥신과 시토키닌의 상호작용에 의해 조절된다. 완두에서 시토키닌은 측아의 생장발생을 촉진하며 옥신은 시토키닌 생합성을 억제한다. 정단을 제거하면 완두의 측아에서 adenosine phosphate- isopentenyltransferase (IPT) 유전자의 발현이 유도되면서 시토키닌 함량이 증가한다. 본 과제에서 완두의 PsIPT2 유전자가 발현되는 형질전환 벼와 애기장대를 각각 생산하였다. 조직특이적인 시토키닌 함량을 조절하기 위해 35S 프로모터 외에도 뿌리특이 프로모터, 종자/분열조직 특이 프로모터를 각각 사용하였다. 애기장대 형질전환체의 표현형을 분석한 결과 계통에 따라 rosette branch의 수가 증가하였음을 확인하였다. 본 결과는 PsIPT2 유전자를 쌍자엽식물의 줄기형성패턴을 조절하는데 유용하게 이용할 수 있음을 보여준다.

IV. 공동연구로 해결된 기술요약

본 국제공동연구를 통해 qRT-PCR 방법을 이용한 유전자 발현 정량분석 기술, 벼의 원형질체에서 transient expression assay를 이용한 유전자의 분자생물학적 기능 연구 기술, 벼 micro RNA 분석 및 발현 정량 기술, 유전자의 조직 특이적 발현을 분석하는 in situ hybridization 기술, 벼와 애기장대 조직 분화 분석 기술 등 작물의 생장분화 연구에 필요한 다양한 분자생물학적 연구기술을 연수하였다. 또한 완두 IPT2 유전자, 벼인산화 효소 유전자, 벼 고분얼 돌연변이체, ABRE 및 cdc2 프로모터 함유 식물발현 벡터 등 연구재료를 도입하였다.

V. 연구결과 활용에 대한 건의 몇 경제성 분석

벼와 밀 등 주요 곡물의 수발아성은 세계 여러 지역에서 양질의 곡물생산을 저해하는 주요 요인이 되고 있다. 이는 일차적인 농업생산성을 저해할 뿐만 아니라 가공 적성을 저하시켜 다양한 2차 농식품 산업에도 큰 경제적 손실을 주고 있는 상황이다. 이런 현상은 최근 기후온난화에 의한 예측하기 어려운 풍수해 피해가 커지면서 중요성이 증가하고 있다. 휴면성 조절 유전자를 수발아 저항성 계통 육성에 이용하여 경제적 효과를 높이는데 기여할 수 있다.

VI. 공동연구 상대국 수행연구기관 현황

1. 기능 및 주요업무

나고야대학은 일본 (구)7대 제국대학의 하나로, 2006년 세계 100대 대학에 선정된 세계적인 명문대학이다. 특히 2001년에는 본대학 Noyori 교수가 노벨화학상을 수상했고, 2008년에는 나고야대학학부를 졸업한 Maskawa 교수, Kobayashi 교수가 노벨물리학상을, 나고야대학 대학원을 수료 후 본 대학 조교수를 지낸 Shimomura 교수가 노벨 화학상을 수상하여, 현재까지 일본에서 수상한 노벨상의 4분의1이 나고야대학에서 배출된 저력을 갖고 있다. 또한 자동차 산업(토요타 자동차)을 비롯해 나고야가 일본산업의 본고장으로 자리매김 하는데 있어서, 나고야대학교이 중요한 역할을 하였다. 나고야 대학은 9개의 학부와 8개의 대학원, 교원, 행정요원, 연구원 등 3,255명의 스탭과 16,356명의 학생으로 구성되어 있다. 또한 환경의학 연구소 등 3개의 연구소와 유전자 연구센터 등 15개의 연구센터를 운영하고 있다.

본 국제공동연구를 수행한 농업생명과학대학원 (Graduate school of Bioagricultural Sciences)은 4개의 department와 19개의 division, 68개의 실험실로 구성되어 있으며 Bioscience and Biotechnology Center와 국제농업교육센터 (ICCAE: Nagoya University International Cooperation Center for Agricultural Education)를 운영하고 있다. 주요 농업형질에 대한 세포분자생물학적 기초연구와 다양한 유전자원을 기반으로 하는 응용연구가 병행되어, 관련 연구소재의 발굴이 우수한 환경으로 다양한 분야의 특정유전자 기능을 분석할 수 있는 첨단기술, 기자재 및 연구재료를 보유하고 있다. Bioscience and Biotechnology Center는 동, 식물 생장분화 조절연구에 대한 세계적 선진 연구센터로서 Dr. Matsuoka, Dr. Ashikari Dr. Mizuno 등 특히 식물호르몬을 이용한 작물생장, 형태발달 및 환경스트레스 반응조절 분야의 세계적 선진연구자가 원예작물 및 벼 등 주곡작물의 관련분야 유전자 및 돌연변이 풀을 보유하고 있다.

2. 인력 및 조치

나고야 대학은 다양한 분야에 대한 9개의 학부 (의학, 공학, 문학, 교육학, 기초과학, 법학, 경제학, 정보학, 농학)와 13개의 대학원 (의학, 공학, 문학, 교육학, 기초과학, 법학, 경제학, 정보학, 농학, 수학, 환경학, 국제개발학, 어문학)으로 구성되어 있다. 인적 구성으로는 1,743여명의 교원과 1,453 명의 행정요원, 연구원 등 3,255명의 스텝과 16,356명의 학생이 등록되어 있다. 또한 환경의학연구소, 태양지구환경연구소, 생태환경과학연구소 등 환경 분야에 특성화된 3개의 연구소와 15개의 연구센터 (방사성연구센터, 유전자 연구센터, 국제교육센터, 재료과학연구센터, 고등교육연구센터, 국제농업교육센터, 연대학연구센터, 박물관, 임상심리개발센터, 생물과학 및 생물기술학 센터, 입자가속센터, 학생카운셀링센터, 국제학생센터 등)를 운영하고 있으며 그 외에도 각 대학원별로 특화된 연구센터를 육성하고 있다. 농업생명과학대학원에는 Bioscience and Biotechnology Center, International Cooperation Center for Agricultural Education, Field Science Center, Avian Bioscience Center가 소속되어 있다.

3. 예산제도

나고야대학은 연구지원을 위한 21세기 COE (Center of Excellence) 프로그램, Global COE 프로그램을 운영하고 있으며, 2006년 기준 정부, 기업 등으로부터 총 69억7천6백 만엔의 연구비를 지원받았다. 산업체와의 협동연구도 활발하게 진행되어 약 415건의 공동연구를 수행중이며 관련 연구비는 9억5천만엔에 달하는데 이 중 생명과학분야는 25%를 차지하고 있다.

4. 최근 연구동향