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SUMMARY

CONTENTS

목차

제1장 연구개발과제의 개요 13

제1절 연구개발의 목적 13

제2절 연구개발의 필요성 13

1. 과학기술적인 측면 13

2. 경제산업적인 측면 17

3. 사회문화적인 측면 19

제3절 연구개발의 범위 20

제2장 국내외 기술개발 현황 21

제1절 국외연구동향 21

1. 신경계질환에 있어서 줄기세포를 이용한 세포치료 연구동향 21

2. 인간 배아줄기세포의 신경분화유도 및 이식기술 개발 24

제2절 국내연구동향 26

제3장 연구개발수행 내용 및 결과 27

1. 확립된 6종 인간 신경줄기세포의 유지, 배양 및 특성분석 27

가. 연구수행방법 27

나. 연구내용 27

가. 연구결과 27

2. 인간 신경줄기세포로부터 희소돌기아교세포로의 분화유도 기술 1종 이상 확립 27

가. 연구수행방법 27

나. 연구내용 27

다. 연구결과 28

3. 인간 신경줄기세포로부터 성상 신경교세포로의 분화유도 기술 1종 이상 확립 28

가. 연구수행방법 28

나. 연구내용 28

다. 연구결과 28

4. 신경줄기세포로부터 신경원세포로의 분화유도 기술 1종 이상 확립 29

가. 연구수행방법 29

나. 연구내용 29

다. 연구결과 29

5. Kindling 간질모델에 인간 신경줄기세포 및 galanin 발현 인간 신경줄기세포 2종 이식하여 세포 및 유전자치료 기술개발 29

가. 연구수행방법 29

나. 연구내용 30

다. 연구결과 30

6. Lithium-Pilocarpine 간질모델에서 인간 신경줄기세포 1종 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술 개발 31

가. 연구수행방법 31

나. 연구내용 31

다. 연구결과 31

7. Lithium-Pilocarpine 간질모델에서 galanin 발현 인간 신경줄기세포 1종 이식하여 줄기세포 이용 세포 및 유전자 치료기술 개발 31

가. 연구수행방법 31

나. 연구내용 32

다. 연구결과 32

8. 척수손상 모델에서 인간 신경줄기세포 유래 희소돌기아교세포 1종 이식하여 세포치료 기술 개발 32

가. 연구수행방법 32

나. 연구내용 32

다. 연구결과 33

9. 척수손상 모델에서 인간 신경줄기세포 유래 신경원세포 1종 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술 개발 33

가. 연구수행방법 33

나. 연구내용 33

다. 연구결과 33

10. 저산소성 허혈성 뇌손상 동물모델에서 인간 신경줄기세포 유래 신경원세포 1종 이상 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술 개발 34

가. 연구수행방법 34

나. 연구내용 34

다. 연구결과 34

11. 저산소성 허혈성 뇌손상 동물모델에서 인간 신경줄기세포 유래 신경교세포 1종 이상 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술 개발 35

가. 연구수행방법 35

나. 연구내용 35

다. 연구결과 35

12. 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상 및 척수손상 환자에서 인간 신경줄기세포/줄기세포 유래 분화세포 이식에 의한 세포치료법 확립하기 위하여 임상적용 단계의 세포배양, 특성 분석, 임상연구방법 및 평가방법 개발하고 연구자 임상연구 시행 36

가. 연구수행방법 36

나. 연구내용 36

다. 연구결과 37

제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 38

제1절 연구개발목표 달성도 38

제2절 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가 42

제3절 관련분야에의 기여도 45

1. 기술적 측면 45

2. 경제.산업적 측면 45

제5장 연구개발결과의 활용계획 47

제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 및 전망 48

1. 성체 (신경) 줄기세포를 이용한 기초연구 동향 48

2. 성체(신경)줄기세포를 이용한 세포치료제 개발에 있어서 해결되어야할 기술적 과제들에 대한 기초 연구동향 48

3. 성체 (신경) 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발에 관한 연구동향 49

4. 전망 50

제7장 연구시설·장비 현황 52

제8장 참고문헌 52

I. 제목

신경줄기세포를 이용한 치료기술 및 분화기전 연구

II. 연구개발의 목적 및 필요성

다양한 해부학적 부위 및 신경발달 단계에 있는 인간의 중추신경계에서 유전자변형 없이 다양한 방법으로 분리 및 배양한 6종의 인간 신경줄기세포를 유지, 배양하여 생체내외에서 특성을 확립하고, 이들 신경줄기세포로부터 기능성 신경세포로의 새로운 분화유도 기술을 4종 이상을 확립한다. 대표적인 난치성 신경계질환인 저산소성 허혈성 뇌손상, 척수질환, 난치성 간질 동물모델을 확보하여 각 질환모델에서 새로운 인간 신경줄기세포 유래 기능성 분화세포를 각각 2종 이상 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술을 개발한다. 신생아 저선소성 허혈성 뇌손상, 척수손상 환자에서 인간 신경줄기세포/줄기세포 유래 기능성 분화세포 이식에 의한 새로운 세포치료법 확립하기 위하여 임상적용 단계의 세포 배양, 특성분석, 임상연구방법 및 평가방법 개발, 연구자 임상연구 시행 및 세포치료법의 안전성/유효성을 평가하여 향후 임상적 적용 가능성에 대비하고 지적재산권을 확보하여 산업화에 기여함을 목적으로 한다.

III. 연구개발의 내용 및 범위

1. 재태연령 13주 태아 중추신경계의 다양한 해부학적 부위에서 채취되어 이미 확립된 6종 인간 신경줄기세포를 계속 배양·유지하고, 장기 계대배양 및 동결보관에 따른 줄기세포의 생존, 증식, 분화, 신경전달물질 발현, 염색체형, 유전자 발현상태 등의 특성변화를 평가

2. 인간 신경줄기세포에 다양한 분화유도 단백질/약물 처리, 배양조건 변화 및 분화유도 관련 유전자를 도입하여 신경원세포, 희소돌기아교세포, 성상세포 둥의 새로운 기능성 신경세포로의 효과적 분화유도기술 4종 이상을 확립하여, 다양한 난치성 신경계질환 모델에 이식 시공여세포의 생착성 및 기능성을 향상시키고, 세포치료의 안전성 및 유효성을 증대시키는 기술개발

3. 약물 저항성 만성 난치성 간질 동물모델로 kindling 모델과 lithium-pilocarpine 주사로 유도한 status epilepticus 모델 확립하고, 인간 신경줄기세포 혹은 항 경련 신경펩타이드인 galanin을 lentivirus로 과 발현시킨 신경줄기세포 2종을 뇌 이식하여 공여세포의 생착, 이주, 분화형태 분석과 숙주동물 뇌의 신경생리, 간질발작 빈도와 정도, 학습과 기억력, 공격성 등 신경행동에 미치는 영향을 분석하여, 줄기세포 이용 세포 및 유전자치료법의 안전성과 유효성을 확립

4. 성체 백서에서 척수손상 동물모델을 확립하고 새로운 인간 신경줄기세포 유래 기능성 분화 세포 2종 이상을 이식하여 공여세포의 생착, 이주, 분화형태 분석과 숙주동물 척수의 신경 생리, 신경회로 및 신경기능에 미치는 영향을 분석하여, 척수손상 재생에 있어서 줄기세포 이용 세포치료술의 안전성과 유효성을 확립

5. 신생 생쥐에서 저산소성 허혈성 동물모델을 확립하고 새로운 인간 신경줄기세포 유래 기능성 분화세포 2종 이상을 이식하여 공여세포의 생착, 이주, 분화형태 분석과 숙주동물 뇌의 신경병리, 신경생리, 신경기능 및 신경행동에 미치는 영향을 분석하여, 뇌손상 재생에 있어서 줄기세포 이용 세포치료술의 안전성과 유효성을 확립

6. 중증 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상 및 척수손상 환자에서 인간 신경줄기세포/줄기세포 유래 기능성 분화세포를 이식하는 연구자 임상연구를 위하여 임상적용 단계의 신경줄기세포 배양, 특성분석, 임상연구방법 및 안전성과 유효성 평가방법 개발, 연구자 임상연구의 시행 및 이식환자를 대상으로 지속적 세포이식술 부작용 발생 monitoring과 신경기능 개선 효과 평가

IV. 연구개발결과

1. 확립된 6종 인간 신경줄기세포의 유지, 배양 및 특성분석; 임신 13주 태아에서 중추신경계 해부학적 부위에 따라 인간 신경줄기세포 6종 계대배양 및 유지함. HFT13은 1년 이상 장기 배양가능하고, 동결보관 한 후 녹인 경우 특성변화 없이 증식/분화함. 줄기세포는 분화 조건에서 각종 신경세포 및 신경전달물질을 발현하여 분화의 다능성을 보임. 분화형태는 줄기세포의 해부학적 위치 및 배양 passage number에 따라 차이를 보임.

2. 인간 신경줄기세포로부터 희소돌기아교세포로의 분화유도 기술 1종 이상 확립; 다양한 재태기간의 태아 뇌에서 추출된 신경줄기세포에 다양한 배양조건 (oligodiff1 조건; SATO media [N2 media+T3+T4+progesterone)+PDGFaa+shh+bFGF+FGF8 and then, SATO media, oligodiff2 조건; N2/B27 media+shh+bFGF+FGF8 and then. N2/B27 media+shh+T3+FGF8) 및 bHLH 전사인자(Olig1. Olig2. NKx2.2)의 과 발현 등을 시행한 결과, oligodiff2 조건이 가장 효율이 좋았음. 일부 줄기세포는 90% 이상에서 희소돌기아교 세포 전구세포로 분화하였고 일부 세포는 5-10%에서 성숙 희소돌기아교세포로 분화하였음.

3. 인간 신경줄기세포로부터 성상 신경교세포로의 분화유도 기술 1종 이상 확립; 인간 신경줄기세포 (HFT13)에 성상교세포 유도성 인자인 BMP4 펩타이드를 첨가한 경우(20ng/ml)/첨가하지 않은 경우에 세포분화 형태; nestin 발현(90%/80-90%), GFAP 발현(95%/80%). TUJ1 발현(12.5%/40%). O4 발현(2%/2%). s100β 발현(90%/0.1%)으로 이를 통해서 BMP4 펩타이드가 성상교세포로의 분화를 촉진하였음. 특히 BMP4 펩타이드를 처리한 세포에서 형태학적으로 성상교세포 모양의 분화가 두드러짐. 인간 신경전구세포의 증식과 분화 상태에서 EAAT1과 EAAT2의 발현이 분화상태에서 증가. 분화상태에서 인간 신경전구세포 (HFT13)는 ³H로 표지된 glutamate를 세포가 배양액으로부터 흡수하는 정도를 시간에 따라 측정하였을 때 glutamate의 세포 내 흡수가 증가되고 이는 인간 태아에서 유래된 성상교세포와 비교했을 때 유사한 양상을 보임. 인간 신경전구세포로부터 분화된 성상교세포는 기능적으로 활성화됨.

4. 신경줄기세포로부터 신경원세포로의 분화유도 기술 1종 이상 확립; 임신 13주 태아 뇌에서 추출된 신경줄기세포에 BMP antagonist인 noggin을 첨가하니 약 70% 세포가 neuron으로 분화함, bHLH gene인 Ngn2을 신경줄기세포에 발현시키면 약 72% (adenovirus 15 moi) 및 95% (adenovirus 40 moi)에서 neuron으로 분화함.

5. Kindling 간질모델에 인간 신경줄기세포 및 galanin 발현 인간 신경줄기세포 2종 이식하여 세포 및 유전자치료 기술개발; adult rat에서 kindling model 확립, 신경줄기세포를 이식하고 8주 후 분석한 결과, 공여세포의 생착, 이주 및 분화 확인, 경련발작의 기간, 정도 및 뇌파발작 기간의 감소. 항 경련 신경펩타이드 galanin 발현 lentiviral vector 제작하여 galanin 발현 인간 신경줄기세포 1종 확립하고 시험관 내 특성 분석함. 본 세포를 간질 모델에 이식하고 8주 후 분석한 결과, 공여세포의 생착, 이주 및 분화 확인, 경련발작의 기간, 정도 및 뇌파발작 기간의 감소 확인.

6. Lithium-Pilocarpine 간질모델에서 인간 신경줄기세포 1종 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술 개발; adult rat에서 lithium -pilocarpine 주사로 status epilepticus 유발하여 난치성 간질모델 확립, 신경줄기세포를 이식하고 공여세포의 생착, 이주 및 분화 확인, 이식군에서 자발경련의 발생률, 빈도의 감소와 전기생리학적 흥분의 감소를 확인함.

7. Lithium-Pilocarpine 간질모델에서 galanin 발현 인간 신경줄기세포 1종 이식하여 줄기세포 이용 세포 및 유전자 치료기술 개발; 항 경련 신경펩타이드 galanin 발현 lentiviral vector 제작하여 galanin 발현 인간 신경줄기세포 1종 확립하고 시험관 내 특성 분석함. 본 세포를 간질 모델에 이식하고 10주 동안 분석한 결과, 경련발작의 발생률, 빈도가 약간 감소함을 확인.

8. 척수손상 모델에서 인간 신경줄기세포 유래 희소돌기아교세포 1종 이식하여 세포치료 기술 개발; adult rat에서 중증 좌상성 척수손상 모델 확립, 인간 신경줄기세포를 oligodiff2 배양조건 하에서 배양하여 희소돌기아교세포 전구세포로 분화 유도하여 척수손상 부위에 이식한 결과, 이식군에서 대조군에 비해 운동기능 향상과 allonydia가 약간 감소함.

9. 척수손상 모델에서 인간 신경줄기세포 유래 신경원세포 1종 이식하여 줄기세포 이용 세포 치료기술 개발; adult rat에서 중증 좌상성 척수손상 모델 확립, 인간 신경줄기세포에 Ngn2 발현 adenovirus 감염시켜 신경원세포로 분화 유도한 세포를 이식한 결과, 공여세포의 생착, 이주 및 분화 확인하고 이식군에서 대조군에 비해 운동기능 향상을 관찰함.

10. 저산소성 허혈성 뇌손상 동물모델에서 인간 신경줄기세포 유래 신경원세포 1종 이상 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술 개발; 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상 모델 확립, 인간 신경줄기세포에 BMP antagonist인 Noggin 처리하여 신경원세포로 분화 유도하여 저산소성 허혈성 뇌 손상 부위에 이식, 공여세포의 생착, 이주 및 신경원 및 희소돌기아교세포로의 분화 확인, 이식군에서 대조군에 비해 뇌손상 크기 감소, 신경학적 기능 및 운동기능 개선이 관찰됨.

11. 저산소성 허혈성 뇌손상 동물모델에서 인간 신경줄기세포 유래 신경교세포 1종 이상 이식하여 줄기세포 이용 세포치료기술 개발; 저산소성 허혈성 뇌손상 동물모델에 인간 신경전 구세포 유래 신경교세포를 이식하니 신경기능의 호전을 관찰할 수 없었음. 따라서 신경줄기세포를 신경원세포로 분화 유도하는 bHLH 전사인자중 하나인 Neurogenin2(Ngn2)를 adenoviral vector 이용 인간 신경줄기세포에 발현하여, 신경줄기세포를 신경원세포로의 분화 유도하고 세포특성 확인함. mouse에서 저산소성 허혈성 뇌손상 모델 확립, 인간 신경줄기세포에 bHLH인 Ngn2 발현 adenovirus 감염시켜 신경원세포로 분화 유도하여 저산소성 허혈성 뇌 손상 부위에 이식한 결과, 공여세포의 생착, 이주 및 신경원세포로의 분화 확인, 이식군에서 대조군에 비해 신경학적 기능 및 운동기능 개선, 숙주 신경계에 대한 신경보호, 주변 대뇌 피질의 신경가소성 개선이 관찰됨.

12. 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상 및 척수손상 환자에서 인간 신경줄기세포/줄기세포 유래 분화세포 이식에 의한 세포치료법 확립하기 위하여 임상적용 단계의 세포배양, 특성분석, 임상연구방법 및 평가방법 개발하고 연구자 임상연구 시행; 기관 IRB와 식약청 승인 하에 인간 신경줄기세포를 연세의대 세포치료실 iGMP 시설에서 배양하고, 세포특성, 안전성, 병원성 및 내독성 등을 확인하여 다수의 임상시험 용 세포를 동결보관함, 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상 및 외상성 척수손상 환자에서 인간 신경줄기세포 이식을 통한 세포치료술 확립을 위한 연구자임상시험 계획서를 기관 IRB 승인을 받고, 식약청에 신청하여 2006년 1월에 승인받음. 2012년 3월 현재까지 저산소성 허혈성 뇌손상 신생아 및 척수손상 환자 총 63명(저산소성 허혈성 뇌손상; 40, 척수손상; 23)에서 인간 신경줄기세포를 이식하는 연구자 임상시험 진행함. 줄기세포 이식받은 저산소성 허혈성 뇌손상 환자는 현재 2명을 제외하고 줄기세포 이식 후 2년 이상 동안 운동기능, 인지기능 및 뇌 MRI 추적검사를 진행하여 안전성 및 유효성을 확인하였음. 줄기세포 이식 받은 척수손상 환자 19명에 대한 1년 추적검사 완료하여 안전성 및 유효성 확인함 (ASIA-B 환자는 100% 신경기능 호전, ASIA-A 환자는 척수손상 2개월 이내 줄기세포 이식받은 경우 30%에서 신경기능 호전).

V. 연구개발결과의 활용계획

1. 다양한 세포특성을 보이는 확립된 다수의 인간 신경줄기세포를 iGMP 시설에서 배양, 유지 및 banking 하여 임상적용을 위한 인간 신경줄기세포 은행 확립하고자 함.

2. 현재 진행 중인 신생아 저산소성 허혈성 뇌손상 (중증 뇌성마비) 및 척수손상 환자에서 신경 줄기세포 이식 임상시험의 안전성 및 유효성 분석을 통하여 난치성 신경계질환에서 신경줄기세포 이용 세포치료의 치료적 유용성 평가와 산업화유도를 도모하고자 함.

3. 세포분화 관련 다양한 유전자 및 신경영양인자 등을 이용하여 보다 치료적 유효성이 높은 기능성 줄기세포 확보 및 세포치료에 활용하고자 함.

4. 신경줄기세포에 임상적 적용이 가능한 보다 안전한 유전자 전달방법 개발하고자 함.

5. 질병의 병태생리 및 숙주의 염증/면역반응을 조절하는 인자를 이용하여 보다 치료적 유효성이 높은 기능성 줄기세포 확보 및 세포치료에 활용하고자 함.

6. 다양한 분야의 연구자들과 협동연구를 진행하여 신경줄기세포에 임상적 적용이 가능한 보다 안전한 유전자 전달방법과 이식 전/후에도 신경줄기세포를 적극적으로 제어/조절할 수 있는 방법을 개발할 예정임.