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SUMMARY
CONTENTS
목차
제1장 연구개발과제의 개요 28
제1절 연구개발대상 기술의 경제적·산업적 중요성 28
제2절 연구개발의 필요성 30
제2장 국내외 기술개발 현황 34
제1절 국외 기술개발 현황 34
제2절 국내 기술 개발 현황 40
제3장 연구개발수행 내용 및 결과 42
제1절 재료 및 방법 42
1. 미세조류의 배양 42
가. 광생물반응기(photo bioreactors;PBRs)을 이용한 미세조류의 배양 42
(1) 실험에 사용된 배지 및 분석 방법 42
(2) 축산폐수에서 조류의 생장 확인 46
(3) 인공축산폐수를 이용한 미세조류 성장의 주요 인자 분석 46
(4) 연속배양을 통한 미세조류의 선정 47
(5) 연속배양을 통한 미세조류 배양인자 도출 48
나. 옥외 배양 (Open raceway pond)을 이용한 미세조류 배양 50
(1) 유기성 폐수를 이용한 미세조류 옥외 배양 mini raceway pond의 운전 50
(2) 생활하수 방류수를 이용한 rayway pond의 운전 51
(3) 옥외배양에서 미세조류 침강 수확조건 검토 및 지질함량 (뉴질랜드에서 실시) 52
다. 미세조류와 박테리아의 상호 작용 53
(1) 미세조류 모니터링을 위한 기반기술 확립 53
(2) 미세조류 커뮤니티의 박테리아 다양성 분석 54
(3) 미세조류와 박테리아의 상호작용 58
2. 미세조류 응집 및 수확 61
가. 미생물 응집제 생산 61
(1) 미생물 응집제를 생산하는 균주 선정 및 배양 61
(2) 배양액으로부터 미생물 응집제의 추출조건 확립 62
(3) 미생물 응집제를 생산하는 균주의 대량배양 및 분석 62
나. 미생물 응집제의 응집활성 확인 및 미세조류 응집조건 최적화 63
(1) 응집효율 확인에 사용된 미세조류의 배양 63
(2) pH변화에 따른 응집효율 65
(3) 응집제 농도 별 응집효율 65
다. 박테리아와 미세조류 상호작용에 의한 응집효과 확인 65
(1) 조류배양액에서 박테리아 유무에 따른 응집효율 측정 및 최적 pH 확인 65
(2) 박테리아가 존재하는 배양액의 응집요인 확인 66
(3) 응집에 관여하는 박테리아 분석 67
(4) 배양액으로부터의 박테리아 순수분리 67
3. 지질 추출 69
가. 추출법 비교 69
나. 추출용매에 따른 lipid 추출 성분의 비교 69
(1) 다양한 용매를 이용한 lipid의 추출 69
(2) Lipid 분석을 위한 TLC 조건 70
(3) TLC 결과의 분석 70
다. Fatty acid methyl ester(FAME) 정량 분석 70
(1) 표준 물질의 선택 70
(2) Fatty aicd 정량을 위한 standard curve 70
라. Wet biomass 추출법 비교 70
제2절 결과 및 고찰 72
1. 미세조류의 배양 72
가. 광생물반응기(photo bioreactors; PBRs)을 이용한 미세조류의 배양 72
(1) 인공 축산 폐수의 제작 72
(2) 축산폐수에서 조류의 생장 확인 73
(3) 인공축산폐수를 이용한 미세조류 성장의 주요 인자 분석 75
(4) 연속배양을 통한 미세조류의 선정 76
(5) 연속배양을 통한 미세조류 배양 인자 도출 78
나. 옥외 배양 (Open raceway pond)을 이용한 미세조류 배양 90
(1) 유기성 폐수를 이용한 미세조류 옥외 배양 mini raceway pond의 운전 90
(2) 생활하수 방류수를 이용한 rayway pond의 운전 109
다. 미세조류와 박테리아의 상호 작용 116
(1) 미세조류 모니터링을 위한 기반기술 확립 116
(2) 미세조류 커뮤니티의 박테리아 다양성 분석 122
(3) 미세조류와 박테리아의 상호작용 133
(2) 미세조류 성장 촉진 물질 탐색 147
2. 미세조류 응집 및 수확 149
가. 미생물 응집제 생산 149
(1) 미생물 응집제를 생산하는 균주 선정 및 배양 149
(2) 미생물 응집제를 생산하는 균주의 대량배양 150
나. 미생물 응집제의 응집활성 확인 및 미세조류 응집조건 최적화 150
(1) pH 변화에 따른 응집효율 151
(2) 미세조류 응집효율에 미치는 응집제 농도 153
나. 박테리아 미세조류 상호작용에 의한 응집효과확인 156
(1) 조류배양액에서 박테리아 유무에 따른 응집효율 측정 및 최적 pH 확인 156
(2) 박테리아가 존재하는 배양액의 응집역할 확인 157
(3) 응집에 관여하는 박테리아 탐색 159
(4) 배양액으로부터 박테리아 순수분리 및 동정 161
3. 지질 추출 163
가. 추출법 비교 163
나. 추출용매에 따른 lipid 추출 성분의 비교 164
(1) TLC 분석 조건 확립 164
(2) TLC 결과의 분석 166
다. Fatty acid methyl ester(FAME) 정량 분석 167
(1) 표준 물질의 선택 167
(2) Fatty aicd 정량을 위한 standard curve 169
라. Wet biomass 추출법 비교 171
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 174
제1절 연구개발목표 달성도 174
제2절 대외기여도 174
제5장 연구개발결과의 활용계획 176
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 178
제7장 연구시설·장비 현황 180
제8장 참고문헌 182
그림 1. 연구의 개요 29
그림 2. 미세조류와 박테리아의 상호작용 31
그림 3. 현재까지 가장 널리 쓰이는 지질추출 및 전환공정 33
그림 4. 미세조류 바이오연료 관련 논문 편수 35
그림 5. 축산폐수의 고도처리 및 지질생산을 위한 Botryococcus 배양 40
그림 6. 인공축산폐수를 이용한 미세조류 성장의 배양인자 분석을 위한 PBR배양 47
그림 7. 미세조류 선정을 위한 연속배양을 위한 실험장치 모식도 48
그림 8. 미세조류 연속배양 장치 구성 49
그림 9. 배양 인자 도출을 위한 연속배양 장치 49
그림 10. Eukaryotic algae로부터 DNA 추출방법 53
그림 11. DGGE의 장치 사진 55
그림 12. Cell sorting을 위한 FACS와 원리 56
그림 13. 미세조류 axenic 유도를 위한 순서도 57
그림 14. 미생물 혼합배양을 통한 미세조류의 성장 촉진 60
그림 15. 5L fermentor에서의 미생물 응집제를 생상하는 균주의 대량배양 63
그림 16. 5L fermentor에서의 응집실험의 seed로 사용된 미세조류(C. vulgaris)배양 64
그림 17. 미생물 응집제를 이용한 flocculating activity 측정방법 64
그림 18. Flocculating activity 측정 방법 66
그림 19. 다양한 배지에서 혼합 미세조류의 배양 74
그림 20. 배양 후 미세조류의 다양성 74
그림 21. 미세조류 배양 중 주요 배양인자의 변화 75
그림 22. 혼합된 미세조류를 이용한 연속배양 76
그림 23. 배양 초기와 정상상태에서의 미세조류 커뮤니티의 변화 77
그림 24. 배양 인자 도출을 위한 연속배양의 세포성장곡선 79
그림 25. 배양 인자 도출을 위한 연속배양의 세포성장 곡선 (log scale) 80
그림 26. 연속배양 중 교반속도에 변화에 따른 미세조류의 성장 변화 81
그림 27. 광조건에 따른 미세조류의 성장. F1;L, F2;L:D(1:1) 82
그림 28. LD cycle에 따른 cell의 변화 83
그림 29. 광량에 따른 미세조류의 성장 84
그림 30. 광량에 따른 DCW의 변화 85
그림 31. Dilution rate의 변화에 따른 cell growth curve 86
그림 32. Dilution rate에 따른 C. vulgaris 수의 변화 87
그림 33. Dilution rate에 따른 cell productivity 88
그림 34. Dilution rate에 따른 Lipid productivity의 변화 88
그림 35. 평형상태에서 온도에 따른 미세조류 셀의 변화 89
그림 36. 유기성 폐수를 이용한 옥외 mini raceway pond에 우점한 미세조류 90
그림 37. 질소와 인의 추가에 따른 미세조류의 건조중량의 변화 91
그림 38. 질소와 인의 추가에 따른 미세조류의 Chlorophyll-a의 변화 92
그림 39. 질소와 인의 추가에 따른 lipid content의 변화 93
그림 40. 질소와 인의 추가에 따른 FAME의 조성분석 94
그림 41. 활성슬러지 공법과 옥외 mini raceway pond의 TN의 변화 95
그림 42. 활성슬러지공법과 옥외 mini raceway pond의 총 질소 제거 효율 95
그림 43. 활성슬러지 공법과 옥외 mini raceway pond의 TP의 변화 96
그림 44. 활성슬러지공법과 옥외 mini raceway pond의 총 인 제거 효율 97
그림 45. 활성슬러지 공법과 옥외 mini raceway pond의 COD의 변화 98
그림 46. 활성슬러지공법과 옥외 mini raceway pond의 COD 제거 효율 99
그림 47. 활성슬러지 공법과 옥외 mini raceway pond의 TN의 변화 100
그림 48. 활성슬러지공법과 옥외 mini raceway pond의 총 질소 제거 효율 101
그림 49. 옥외 mini raceway pond의 NH₃-N의 변화 102
그림 50. 활성슬러지 공법과 옥외 mini raceway pond의 TP의 변화 103
그림 51. 활성슬러지공법과 옥외 mini raceway pond의 총 인 제거 효율 103
그림 52. 활성슬러지 공법과 옥외 mini raceway pond의 COD의 변화 105
그림 53. 활성슬러지공법과 옥외 mini raceway pond의 COD 제거 효율 105
그림 54. 옥외 mini raceway pond에서 배양한 미세조류의 침전능 106
그림 55. 옥외 mini raceway pond의 Biomass의 변화 107
그림 56. 처리구별 Chl-a 농도 변화의 비교 109
그림 57. 처리구별 인 제거율과 질소 제거율의 비교 110
그림 58. 처리구별 지질생산성의 비교 111
그림 59. 부착조류 배양조(위)와 부유조류 배양조(아래)의 투명도 차이 113
그림 60. 부유성 미세조류와 부착성 미세조류의 단위면적당 바이오매스 생산성의 비교 114
그림 61. 부유성 미세조류와 부착성 미세조류의 질소(nitrogen)제거율 비교 114
그림 62. 부유성 미세조류와 부착성 미세조류의 인(phosphorus)제거율 비교 115
그림 63. 제작된 primer의 18S rRNA에서의 위치 118
그림 64. primer set을 이용한 PCR 증폭 결과 119
그림 65. Rubisco gene을 target으로 하는 primer를 이용한 DGGE분석 120
그림 66. Phyco-sphere bacteria의 DGGE 122
그림 67. Chlorella vulgaris와 커뮤니티를 형성하는 박테리아 다양성 125
그림 68. 미세조류 커뮤니티 내 박테리아 다양성 분석을 위한 PCA 분석 125
그림 69. 인공축산폐수를 이용한 enrichment에서 Chlorella νugaris와 커뮤니티를 형성하는 박테리아 다양성 126
그림 70. Chlorella enrichment culture에서 박테리아의 분리 127
그림 71. FACS를 이용한 미세조류 cell sorting 129
그림 72. 배양방법에 의한 axenic의 확인 130
그림 73. Axenic 유도를 위한 각 단계별 박테리아 다양성의 변화 131
그림 74. Microscope를 이용한 axenic의 확인 132
그림 75. 영양 조건에 따른 미세조류의 배양 134
그림 76. 형광현미경을 이용한 미세조류의 관찰 134
그림 77. 영양조건에 따른 FAME의 변화 135
그림 78. FACS를 이용한 미세조류와 박테리아의 분리 136
그림 79. 영양상태에 따른 미세조류와 박테리아의 개체수 변화 137
그림 80. DGGE를 위한 PCR product 138
그림 81. DGGE를 이용한 미세조류와 박테리아의 다양성 분석 139
그림 82. Pyrosequencing을 이용한 부착성 박테리아와 부유성 박테리아의 분포 140
그림 83. 영양조건, 부착여부에 따른 군집 유사도 분석 140
그림 84. Axenic과 xenic C.vulgaris의 배양 141
그림 85. 형광현미경을 이용한 axenic의 확인 142
그림 86. Axenic과 xenic culture의 FAME 비교 분석 143
그림 87. Co-cultivation 동안의 cell growth 144
그림 88. DAPI 염색과 Fluorescence microscope를 이용한 미세조류와 박테리아의 관찰 145
그림 89. Co-cultivation 중 미세조류와 박테리아의 균체수 146
그림 90. 박테리아 배양액 fraction별 미세조류 성장 촉진 148
그림 91. 혼합배양 한 C. vulgris의 FAME 분석 148
그림 92. 세포외 미생물성 다당류를 생산하는 Bacillus sp. A8과 Paenibacillus sp. AM49 149
그림 93. Bacillus sp. A8 배양 후 얻은 분말다당류 150
그림 94. Bacillus sp. A8의 batch culture의 시간대별 분석 150
그림 95. Cationic chemical 및 미생물응집제 첨가에 따른 pH별 응집효율 152
그림 96. pH 7과 pH 11에서의 응집효율 비교 152
그림 97. Bacillussp.A8의 미생물응집제 농도별 응집효율 154
그림 98. 미생물응집제 첨가유무에 따른 응집효율 비교 155
그림 99. Bacillus sp. A8의 미생물응집제를 이용한 응집효율 최적 조건 155
그림 100. Axenic Cvulgaris cell과 cell-free xenic 배양액을 혼합한 시료의 응집효율 확인 158
그림 101. 최적 pH11에서의 axenic, incomplete axenic, xenic의 응집 비교 158
그림 102. Xenic culture의 박테리아 커뮤니티 분석 159
그림 103. C.vulgaris와 incomplete axenic 배양액의 박테리아 커뮤니티 분석 160
그림 104. R2A, TSB agar, Nutrient agar, BG11 + glucose 1000ppm, BG11 + glucose 20ppm agar plate를 이용한 박테리아분리 161
그림 105. TLC 분석을 이용한 lipid의 성상 분석 164
그림 106. 균주별 TLC 결과 165
그림 107. B. barunii lipid의 분리 된 band 분석 166
그림 108. FAME standard 비교 168
그림 109. 각 fatty acid의 정량선 170
그림 110. FAME Contents according to reaction conditions (upper) and FAME compositions (bottom) 172
그림 111. 자동조절 시스템이 부착된 광생물 반응기 180
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