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Title Page

Contents

ABBREVIATIONS 8

Abstract 9

INTRODUCTION 11

MATERIALS AND METHODS 17

Cell culture and conditioned medium 17

Western blotting, RT-PCR, and real-time PCR 18

Snail and Wnt1 transfection 18

Short hairpin RNA (shRNA) interference 21

Assay for endogenous cellular oxygen consumption and cytochrome c oxidase (COX) activity 21

Glucose consumption assay, lactate production assay, and adenosine 5'-triphosphate (ATP) determination 24

RESULTS 26

1. Decrease in mitochondrial respiration and COX by Wnt 26

2. Wnt3a induces glycolytic switch 30

3. Wnt-Snail cascade inhibits mitochondrial respiration and induces glycolytic switch 30

4. Inhibition of COX gene expression by Wnt-Snail cascade 33

Discussion 47

REFERENCES 58

국문요약 65

List of Tables

Table 1. Primer sequences used in this study 19

Table 2. shRNA constructs used in this study 22

Table 3. COX VIc, COX VIIa, COX VIIc, COX18, and SCO2 expression by... 44

List of Figures

Figure 1. Epithelial-to-Mesenchymal Transition by the Wnt-Snail signal cascade. 14

Figure 2. Repression of mitochondrial respiration by Wnt3a conditioned medium. 27

Figure 3. Repression of mitochondrial respiration by recombinant Wnt3a. 28

Figure 4. Repression of mitochondrial respiration by Wnt1. 29

Figure 5. Induction of glycolytic switch by Wnt3a. 31

Figure 6. Implication of Snail in Wnt regulation of mitochondrial respiration. 34

Figure 7. Effects of shSnail on Wnt induced glycolytic switch. 35

Figure 8. Effects of shAxin1, shAxin2, and shTCF4 on Wnt regulation of... 37

Figure 9. Mitochondrial Complex IV: cytochrome C oxidase (COX). 38

Figure 10. Effects of Wnt3a on COX VIc, COX VIIa, COX VIIc, COX18, and... 40

Figure 11. Effects of Wnt3a on COX subunits expression. 41

Figure 12. Effects of shSnail on inhibition of E-cadherin, COX VIc, COX... 42

Figure 13. Effects of shAxin2 on inhibition of E-cadherin, COX VIc, COX... 43

Figure 14. Snail E box is found in the promoters of COX VIc, COX VIIa,... 45

Figure 15. Wnt signaling represses transcription of E-cadherin, COX VIc,... 46

Figure 16. A schematic model for the role(s) of Wnt-Snail cascade in the... 49

초록보기

Wnt는 세포 성장, 분화, 세포 사멸 등의 다양한 세포 기능에 관여하는 cytokine으로 Wnt 신호전달의 이상은 다양한 암의 발생을 유도한다. Wnt 신호전달은 Snail-mediated epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)를 유도함으로써 tumor promoter의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 암세포는 정상세포와 달리 산소가 충분한 상태에서 미토콘드리아 산소호흡이 아닌 해당과정을 통해 에너지를 획득하는 glycolytic switch 현상을 보인다. 이러한 현상은 악성종양세포에서 나타나는 보편적인 특징으로 이를 조절하는 기작은 정확히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 tumor promoter로써의 Wnt 신호전달의 또 다른 역할을 규명하고 이에 관여하는 조절 유전자를 발굴하고자 하였다. Non-invasive breast cancer cell인 MCF-7 에 Wnt3a를 처리하여 Wnt3a가 전자전달계의 complex IV의 유전자 발현을 억제함으로써 미토콘드리아 산소호흡과 전자전달계의 활성을 감소시킴을 확인하였다. 그리고 Wnt3a에 의해 glycolytic switch가 나타남을 확인하였다. 이에 Wnt 신호전달이 glycolytic switch를 조절하는 기작을 조사하였다. Wnt 신호전달에 의해 활성화되는 Snail의 기능을 확인하고자, Snail RNA interference를 이용하여 Snail 발현을 억제시킨 세포에 Wnt3a를 처리하였을 때, Wnt3a에 의해 감소하였던 미토콘드리아 산소호흡이 회복되고, glucose 소비량과 lactate 생산량이 감소함을 확인하였다. 다음으로 Wnt signaling molecule인 Axin1, Axin2, TCF4를 knockdown 시킨 세포에서도 Wnt3a를 처리하였을 때 Wnt3a에 의해 감소되었던 미토콘드리아 산소호흡이 회복되고, glycolytic switch 현상이 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 Wnt-Snail cascade가 미토콘드리아 산소호흡 억제를 통한 glycolytic switch 현상을 유도함을 알 수 있었다.

Wnt-Snail cascade에 의한 미토콘드리아 산소호흡 억제를 조절하는 유전자를 탐색하기 위해 Wnt에 의해 억제되었던 complex IV subunit과 assembly factor에 shSnail과 shAxin2가 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 Wnt-Snail cascade 또는 Wnt-Axin2-Snail cascade에 의해 complex IV subunit인 COX VIc, COX VIIa, COX VIIe와 assembly factor인 COX18의 발현이 조절 됨을 알 수 있었다. 이상의 결과는 Wnt 신호전달이 complex IV의 유전자 발현을 조절함으로써 미토콘드리아 기능을 조절하여 glycolytic switch를 유도함을 말해준다. 나아가 이는 암의 발생을 조절할 것으로 보여진다.

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