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Title Page 1

Contents 4

Abbreviation 8

Abstract 9

1. Introduction 11

2. Materials and Methods 13

2.1. Animals 13

2.2. Experimental groups and schedules 13

2.3. Acupuncture stimulation 17

2.4. cDNA Microarray analysis 19

2.5. Western blot analysis 20

2.6. Histological analysis 21

2.7. U0126 administration 23

2.8. Mouse-formalin test and behavior assessment 23

2.9. Statistical analysis 27

3. Results 28

3.1. Changes of gene expression level in the skin layer by acupuncture 28

3.2. Changes of protein expression level in the skin layer by acupuncture 32

3.2.1. Phospho-ERK expression level in the skin layer after acupuncture stimulation 32

3.2.2. Phospho-p38 expression level in the skin layer after acupuncture stimulation 34

3.2.3. Phospho-JNK expression level in the skin layer after acupuncture stimulation 36

3.2.4. Substance P expression level in the skin layer after acupuncture stimulation 38

3.3. Expression of phospho-ERK in the skin layer by acupuncture 40

3.4. Inhibition of acupuncture-induced ERK activation using U0126 in the skin layer 44

3.5. Effect of acupuncture on formalin-induced pain behavior and inhibition of acupuncture effect by U0126 46

4. Discussion 49

Reference 52

Korean Abstract 57

List of Tables 7

Table 1. Experimental groups of mouse-formalin test and drug treatments 16

Table 2. KEGG pathway based on comparison of gene expression between the Acu and Control... 31

List of Figures 6

Figure 1. Experimental schedules for cDNA Microarray, Western blotting and immunostaining.... 15

Figure 2. Location of the acupuncture point GB34 used in this study 18

Figure 3. Schedules of the mouse-formalin test and behavior assessment 25

Figure 4. The site of formalin injection in the right hind paw 26

Figure 5. Correlation matrix plot analysis between Acu group and Control group 30

Figure 6. Phospho-ERK expression in the skin layer after acupuncture stimulation 33

Figure 7. Phospho-p38 expression in the skin layer after acupuncture stimulation 35

Figure 8. Phospho-JNK expression in the skin layer after acupuncture stimulation 37

Figure 9. Substance P expression in the skin layer after acupuncture stimulation 39

Figure 10. Phospho-ERK expression in the skin layer by acupuncture (Immunohistochemistry) 41

Figure 11. Phospho-ERK expression in the skin layer by acupuncture (Immunofluorescence) 43

Figure 12. Inhibition of acupuncture-induced ERK activation in the skin layer by U0126 45

Figure 13. Analgesic effect of acupuncture stimulation on formalin induced nociceptive... 48

초록보기

 침 치료는 다양한 질환에서 효과적인 치료법으로 사용되고 있다. 침의 치료효과를 과학적으로 증명하기 위해서는 침 치료의 기전, 특히 침의 자극이 시작되는 단계에서의 기전을 밝하는 연구가 필요하다. 본 연구에서는 침 치료 후 국소적으로 변화하는 인자와, 통증을 유발한 동물모델에서 나타나는 침의 치료효과간의 상관관계에 관한 연구를 수행하였다. 먼저 첫 단계로, C57BL/6 마우스의 양릉천 혈자리에 침 치료 후 1시간 뒤에 국소적으로 변화하는 인자들을 RNA 레벨에서 관찰하였다. 그 결과 MAPK 신호전달경로, 면역체계 관련 인자들, Toll-like receptor 신호전달경로 등이 유의하게 변화하였다. 여기서 MAPK 신호전달경로가 가장 많은 유전자를 포함하고 있었으므로, 이를 지표물질로 삼고 이후 실험을 진행하였다. 두 번째 단계에서는 MAPK 신호전달경로 관련인자를 단백질 레벨에서 관찰하였다. Phospho-ERK의 변화가 크게 나타났는데, 5분에 가장 많이 발현되었고, 30분 까지 발현이 되지만, 점점 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 ERK의 발현은 자침 후 초기에 크게 나타나는 것을 알 수 있다. p38, JNK의 변화량은 ERK의 발현과 비슷한 경향으로 나타났지만, 변화량이 ERK에 비해서 매우 적었고, JNK같은 경우 자침 전에 비해 유의한 차이를 보이지 않았으므로, 이들이 하는 역할은 적을 것이라 가정하였다. ERK 발현의 상위단계를 밝혀내기 위하여 substance P의 변화량을 분석하였다. 통계적인 유의성은 없었으나, 자침 후 substance P의 발현량이 증가하는 것을 볼 수 있었고, 발침 후 30분까지 지속되는 경향을 보였다. 피부에서 발현되는 ERK가 피부의 어느 부위에서 발현되는지를 알아보기 위해, 면역염색을 진행하였다. 여기서는 ERK의 발현이 크게 나타나는 5분과 감소되는 30분을 택하여 실험하였다. 그 결코나, 이전과 동일하게 5분에 증가하고 30분에 감소되는 경향을 볼 수 있었으며, 피부 진피층의 fibroblast와 표피층의 keratinocyte에서 발현되는 것을 관찰하였다.

마지막 단계로, 침 자극 후 피부에서 발현되는 인자들이 침의 치료효과와 어떤 연관관계가 있는지를 pain model을 통해 연구하였다. ERK의 발현을 차단하기 위해 U0126이라는 약물을 사용하였다. 통증 행동양상을 관찰한 결과, formalin 그룹에 비해 침은 유의한 진통효과를 보여주었고, inhibitor에 의해 침의 진통효과가 유의한 정도로 차단이 되었다. 따라서, 침 치료 후 양릉천 혈자리의 skin layer에서 발현되는 ERK가 침의 자극이 전달되어 치료효과를 나타내게 하는데 중요한 역할을 한다고 결론을 내릴 수 있다.

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