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Title Page

Contents

ABSTRACT 10

초록 (Abstract in Korean) 13

Chapter I. LITERATURE REVIEW 17

1.1. Introduction 18

1.2. Low quality of cloned embryos 18

1.3. Genetic and morphological abnormality of cloned embryos 19

1.4. Abnormal placenta of cloned animals 20

1.5. References 22

Chapter II. Identification of Abnormal Expressed Proteins in Early-stage Placenta derived from Cloned Cat Embryos using Proteomic Technique 28

2.1. ABSTRACT 29

2.2. Introduction 31

2.3. Materials and Methods 33

2.3.1. Animal use 33

2.3.2. Artificial Insemination (AI) 33

2.3.3. Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) 34

2.3.4. Protein preparation 34

2.3.5. Proteomics analysis of cloned placenta derived from cat embryos 34

2.3.6. Statistics 34

2.4. Results and Discussion 35

2.4.1. Abnormal morphology of early-stage placenta and abnormal distribution of vessels from the cloned fetus 35

2.4.2. Two-dimensional electrophoresis (2-DE) analysis 36

2.4.2. Identification of differentially expressed proteins by MALDI-TOF/ MS 36

2.4.3. Validation of proteins by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry 41

2.4.4. Classification of identified proteins 42

2.5. Conclusion 43

2.6. References 45

Chapter III. Proteomic Analysis of Placentas from Cloned Cat Embryos Identifies a Set of Differentially Expressed Proteins Related to Oxidative Damage, Senescence and Apoptosis 59

3.1. ABSTRACT 60

3.2. Introduction 62

3.3. Materials and Methods 65

3.3.1. Somatic cell nuclear transfer (SCNT) 65

3.3.2-DE and mass spectrometry analysis 66

3.3.3. Western blot analysis 69

3.3.4. Detection of CD and PHB in cloned term placental cells 70

3.3.5. In situ determination of ROS generation and measurement of mitochondrial membrane potential 72

3.3.6. Measurement of telomeric DNA in CTP 73

3.3.7. TUNEL assay 75

3.3.8. Statistics 75

3.4. Results 76

3.4.1. Identification of differentially expressed proteins in CTP 76

3.4.2. Protein classification and confirmation of PHB and CD expression 77

3.4.3. ROS and antioxidant enzyme activity in CTP 78

3.4.4. Telomeric DNA level in CTP 79

3.4.5. Apoptosis in CTP 80

3.4.6. Protein-protein interaction (PPIs) networks 80

3.5. Discussion 82

3.6. References 90

List of Tables

Chapter II. Identification of Abnormal Expressed Proteins in Early-stage Placenta derived from Cloned Cat Embryos using Proteomic Technique 8

Table 1. Identification of up-regulated proteins in cloned early-stage placenta derived from cloned cat embryos by SCNT. 55

Table 2. Identification of down-regulated proteins in cloned early-stage placenta derived from cloned cat embryos by SCNT 56

Table 3. Validation of identified proteins in CEP by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry 57

Table 4. Validation of identified proteins in CEP by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry 58

Chapter III. Proteomic Analysis of Placentas from Cloned Cat Embryos Identifies a Set of Differentially Expressed Proteins Related to Oxidative Damage, Senescence and Apoptosis 8

Table 1. Identification of differentially expressed proteins in term placenta derived by SCNT 111

Table 2. Relative amount of telomeric DNA in tissue cells 113

List of Figures

Chapter II. Identification of Abnormal Expressed Proteins in Early-stage Placenta derived from Cloned Cat Embryos using Proteomic Technique 6

Figure 1. The figures of placentas from cloned and control fetus and two-dimensional gel electrophoresis 52

Figure 2. Differentially expressed spots and relative intensities in control and cloned placenta 53

Figure 3. Classification of differentially expressed proteins 54

Chapter III. Proteomic Analysis of Placentas from Cloned Cat Embryos Identifies a Set of Differentially Expressed Proteins Related to Oxidative Damage, Senescence and Apoptosis 6

Figure 1. 2-DE maps and relative spot intensity in CTP 98

Figure 2. Identification of PHB using MALDITOF MS and MS/MS spectra and confirmation by western blot and IF analysis 100

Figure 3. Identification of CD using MALDITOF MS and MS/MS spectra and confirmation by western blot and IF analysis 103

Figure 4. Measurement of ROS generation in 89-91 CTP by carboxy-H₂DCFDA assay 106

Figure 5. Analysis of placental cell apoptosis by TUNEL assay 109

Figure 6. Western blotting analysis of apoptosis proteins (Bax, Cyt c, p53, caspase-9, caspase-3) 110

초록보기

복제는 1997 년에 체세포복제 (SCNT)기술을 이용하여 복제양 "돌리" 생산을 성공하였다. 1997 년 복제성공 이래 다양한 종, 쥐, 소, 돼지, 원숭이, 고양이, 개 그리고 여우에서 복제를 성공하였다. 이 복제기술은 농가의 소득증대, 의약 그리고 멸종위기종 복원에 있어서 매우 유용한 기술이다. 그러나 복제수정란이 분만 때까지 정상적으로 발달되는 것은 0.5%에서 5%정도로 매우 어렵다. 이렇게 발달률이 저조한 원인으로 종종 도너세포와 복제수정란의 과메틸화, 유전자의 재프로그래밍 이상 그리고 복제동물 기관의 기능 부전과 같은 문제점 들이 종종 보고되었다. 이러한 것이 임신기간 동안 복제 동물의 이상 기능과 발달이 주요 원인이라고 생각된다.

In chapter II

이번 장은 이상 발현되는 단백질이 착상 후 임신초기에 임신유지와 산자의 생존성에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. 이 분석을 위하여 복제 (n＝2)와 일반 (n＝4) 산자들로부터 태반을 각각 확보하였다. 먼저, 각 그룹의 태반으로부터 전체 400 ug 의 분리된 단백질을 pH 3~10 IPG strip 을 이용하여 pH 별로 나누었다. 두번째, 일차분리 된 단백질은 12% SDS-PAGE 을 이용하여 분자량 별로 2 차 분리를 하였다. 이차원 전기영동과 매트릭스 보조 레이저 탈착 비행시간차 질량분석기를 이용하여 일반태반과 비교했을 때 복제 태반에서 전체 21 개의 이상 발현되는 단백질들을 동정하였다. 동정한 단백질들 중에서, 일반 태반과 비교했을 때 복제 태반에서 유의적으로 상향 발현되는 12 개의 단백질을 확인하였다(p<0.05). 이와 반대로, 일반태반과 비교하였을 때 복제태반에서 하향 발현되는 9 개의 단백질을 확인하였다(p<0.05). 이렇게 이상 발현되는 단백질의 정보는 NCBI 와 Swiss-Prot 데이터베이스로부터 확보하였다. 21 개의 동정된 단백질들은 매트릭스 보조 레이저 탈착 비행시간차/탈착 비행시간차 탄뎀 질량 분석기를 이용하여 일치하는 펩타이드 시퀀싱을 통하여 검증하였다. 그러므로 복제태반에서 이상 발현되는 단백질들은 아마도 초기 임신기간 동안 임신의 유지 및 산자의 유실에 대하여 상호 밀접한 관계에 있을 것으로 생각된다.

In chapter III

이번 장의 연구목적은 분만 후에 태반에서 이상 발현되는 단백질들이 비정상적인 태반의 발달과 기능 그리고 산자의 생존성과 연관이 있는지 여부를 조사하였다. 우리는 자연분만과 제왕절개의 두 가지 방법을 통하여 임신 65 일 때 고양이 수정란 유래 일반 태반 (n＝3)과 복제 태반 (n＝3)을 확보하였다. 우선적으로, 우리는 두 가지 다른 방법으로 확보한 일반과 복제태반으로부터 발현되는 유전자 발현차이 여부를 확인해 본 결과 회수 방법에 따른 유전자 발현에 유의적인 차이가 없었다 (p>0.05). PDQuest 소프트웨어를 이용하여 일반 태반과 비교하여 복제태반에서 최소 1.5 배 유의적으로 차이가 나는 spots 을 20 개 발견하였다 (p<0.05). 20 개의 이상 발현되는 단백질들 중 13 개의 단백질은 복제태반에서 상향발현 되었다. 이와 반대로 9 개의 단백질은 일반태반과 비교하였을 때, 복제 태반에서 하향 발현되었다. 복제태반에서 이상 발현되는 단백질의 정보는 NCBI 와 Swiss-Prot 의 데이터 베이스를 기초하였다. 상향 발현되는 단백질들 중 cathepsin D (CD)는 ROS 생성과 연관이 있다. 이는 미토콘드리아 기능의 장애와 복제 태반의 세포사에 영향을 미친다. 부가적으로 하향 발현되는 단백질 중에 prohibitin(PHB)은 산화적 스트레스, 노화와 아포토시스에 연관성이 있다. 이렇게 이상 발현되는 단백질들은 분만 후 태반의 이상기능에 영향을 줄 것이고 이는 결국 분만 후 산자의 사망률에 영향을 미칠 것이다.

General conclusion

이번 연구에서 프로테오믹스 기술을 이용하여 임신 초기 (21th day)와 분만 후 복제 태반에서 이상 발현되는 단백질들을 확인하였다. 일반태반과 비교하였을 때 복제태반에서 발현되는 이상 단백질들은 최소 1.5 배 이상 상향 또는 하향발현되었다. 동정된 상향 발현되는 단백질들은 산화적 스트레스와 세포사와 연관이 있었다. 그리고 동정된 하향발현되는 단백질들은 세포노화와 아포토시스와 연관이 있었다. 이렇게 여러 이상 발현되는 단백질들은 태반의 발달과 임신유지에 악영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 결국 체세포복제 후 복제 산자의 낮은 생존성의 원인이 된다.

참고문헌 (125건) : 자료제공( 네이버학술정보 )

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번호 참고문헌 국회도서관 소장유무
1 Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. 네이버 미소장
2 Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. 네이버 미소장
3 Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. 네이버 미소장
4 Eight Calves Cloned from Somatic Cells of a Single Adult 네이버 미소장
5 Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin. 네이버 미소장
6 A cat cloned by nuclear transplantation. 네이버 미소장
7 Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells 네이버 미소장
8 Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. 네이버 미소장
9 2002. Production of cloned cattle from in vitro systems. Biol. Reprod. 67(1) : 327-333. 미소장
10 Production of Cloned Goats after Nuclear Transfer Using Adult Somatic Cells 네이버 미소장
11 A Mule Cloned from Fetal Cells by Nuclear Transfer 네이버 미소장
12 Dogs cloned from adult somatic cells. 네이버 미소장
13 Endangered wolves cloned from adult somatic cells. 네이버 미소장
14 Conservation of Methylation Reprogramming in Mammalian Development: Aberrant Reprogramming in Cloned Embryos 네이버 미소장
15 Dnmt1 overexpression causes genomic hypermethylation, loss of imprinting, and embryonic lethality. 네이버 미소장
16 Dynamic Reprogramming of DNA Methylation in the Early Mouse Embryo 네이버 미소장
17 2004. Biol Reprod. 70(1): 1-11. 미소장
18 Aberrant epigenetic changes and gene expression in cloned cattle dying around birth. 네이버 미소장
19 Transcriptional reprogramming of somatic cell nuclei during preimplantation development of cloned bovine embryos 네이버 미소장
20 2002. Prequency and occurrence of late-gastation losses from cattle cloned embryos. Biol Reprod. 66(1): 6-13. 미소장
21 Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. 네이버 미소장
22 Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cell. Nature. 415:1035-1038. 미소장
23 Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature Sertoli cells. 네이버 미소장
24 Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev. 58:376-383. 미소장
25 Coordination between donor cell type and cell cycle stage improves nuclear cloning efficiency in cattle. Theriogenology. 59:45- 59. 미소장
26 Production of a cloned calf from a fetal fibroblast cell line 네이버 미소장
27 Generation of mice from wild-type and targeted ES cells by nuclear cloning. Nat. Genet. 24:109-110. 미소장
28 Cloning animals by somatic cell nuclear transfer – biological factors 네이버 미소장
29 Association of Arsenic-Induced Malignant Transformation with DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression 네이버 미소장
30 Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos. 네이버 미소장
31 DNA methylation variation in cloned mice 네이버 미소장
32 The significance of mitochondria for embryo development in cloned farm animals. 네이버 미소장
33 Abnormal gene expression in extraembryonic tissue from cloned porcine embryos 네이버 미소장
34 PROTEOMICS Reviews 2008 네이버 미소장
35 Proteomic analysis of the extraembryonic tissue from cloned porcine embryos. 네이버 미소장
36 2005. Protein profiles of bovine placenta derived from somatic cell nuclear transfer. Proeomics. 5(16):4264-4273. 미소장
37 Abnormal expression of TIMP-2, SOD, vimentin and PAI proteins in cloned bovine placentae. 네이버 미소장
38 Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. 네이버 미소장
39 Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. 네이버 미소장
40 Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. 네이버 미소장
41 Epidemiology in Central and Eastern Europe 네이버 미소장
42 2006. Proteomic analysis of the extraembryonic tissue from cloned porcine embryos. Mol. Cell Proteomics. 5: 1559-1566. 미소장
43 Abnormal Expression of Trophoblast Major Histocompatibility Complex Class I Antigens in Cloned Bovine Pregnancies Is Associated with a Pronounced Endometrial Lymphocytic Response 네이버 미소장
44 Protein profiles of bovine placenta derived from somatic cell nuclear transfer 네이버 미소장
45 Carbonic anhydrase activity in different placenta types: A comparative study of pig, horse, cow, mink, rat, and human 네이버 미소장
46 Extracellular Matrix Components and Matrix Degrading Enzymes in the Feline Placenta during Gestation 네이버 미소장
47 The placenta of the pig. I. Finestructural changes of the placental barrier during pregnancy. 네이버 미소장
48 1974. Ultrastructural evolution of the placental labyrinth of the cat (author's transl), Anat. Embryol. (Berl). 146: 1-20. 미소장
49 Placental angiogenesis in sheep models of compromised pregnancy 네이버 미소장
50 Cloning and Characterization of Cat POU5F1 and NANOG for Identification of Embryonic Stem-like Cells 네이버 미소장
51 Cats cloned from fetal and adult somatic cells by nuclear transfer. 네이버 미소장
52 Proteomic analysis of placentas from cloned cat embryos identifies a set of differentially expressed proteins related to oxidative damage, senescence and apoptosis. 네이버 미소장
53 Generation of Cloned Transgenic Cats Expressing Red Fluorescence Protein 네이버 미소장
54 Oxygen Stress Increases Prolyl cis/trans Isomerase Activity and Expression of Cyclophilin 18 in Rabbit Blastocysts 네이버 미소장
55 Annexin 2: a Novel Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Binding Protein Involved in Replication in Monocyte-Derived Macrophages 네이버 미소장
56 Increased DJ-1 expression under oxidative stress and in Alzheimer's disease brains 네이버 미소장
57 Simultaneous release of adenylate kinase and cytochrome c in cell death. 네이버 미소장
58 Messenger RNA encoding thiol protein disulphide isomerase in amnion, chorion and placenta in human term and preterm labour 네이버 미소장
59 Endocrine disruption for endocrinologists (and others). 네이버 미소장
60 Molecular markers of preterm labor in the choriodecidua. 네이버 미소장
61 Inhibition of angiogenesis in vitro: A central role for β-actin dependent cytoskeletal remodeling 네이버 미소장
62 The roles of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in tumour development and progression. 네이버 미소장
63 Tropomyosin 4 defines novel filaments in skeletal muscle associated with muscle remodelling/regeneration in normal and diseased muscle 네이버 미소장
64 Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. 네이버 미소장
65 Cytosolic accumulation of HSP60 during apoptosis with or without apparent mitochondrial release: evidence that its pro-apoptotic or pro-survival functions involve differential interactions with caspase-3. 네이버 미소장
66 Matricellular proteins as modulators of wound healing and the foreign body response. 네이버 미소장
67 Calumenin interacts with serum amyloid P component 네이버 미소장
68 Comprehensive analysis of keratin gene clusters in humans and rodents 네이버 미소장
69 Keratin 8 Protection of Placental Barrier Function 네이버 미소장
70 Prohibitin-1 maintains the angiogenic capacity of endothelial cells by regulating mitochondrial function and senescence. 네이버 미소장
71 Preoperative serum albumin level as a predictor of operative mortality and morbidity: results from the National VA Surgical Risk Study. 네이버 미소장
72 The tryptic peptides of rabbit muscle triose phosphate isomerase. 네이버 미소장
73 1989. haracterization of triosephosphate isomerase mutants with reduced enzyme activity in Mus musculus, Genetics .123: 837-844 미소장
74 Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. 네이버 미소장
75 Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. 네이버 미소장
76 Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. 네이버 미소장
77 Aberrant expression of developmentally important signaling molecules in cloned porcine extraembryonic tissues. 네이버 미소장
78 Evaluation of gestational deficiencies in cloned sheep fetuses and placentae. 네이버 미소장
79 Placental anomalies in a viable cloned calf. 네이버 미소장
80 The role of the placenta in nutrition of the human fetus. Am J Obstet Gynecol 1991, 164, 967-973. 미소장
81 Actions of placental and fetal adrenal steroid hormones in primate pregnancy. 네이버 미소장
82 State of cat genomics. Trends Genet 2008, 5, 268-279. 미소장
83 Development and characteristics of placentation in a carnivore, the domestic cat. 네이버 미소장
84 Mechanisms and Genes of Cellular Suicide 네이버 미소장
85 Mitochondrial control of apoptosis: the role of cytochrome c. 네이버 미소장
86 Cats cloned from fetal and adult somatic cells by nuclear transfer. 네이버 미소장
87 Comparative proteomic analysis associated with term placental insufficiency in cloned pig. 네이버 미소장
88 Comparative proteomic analysis of human placenta derived from assisted reproductive technology. 네이버 미소장
89 Isolation of Multipotent Cells from Human Term Placenta 네이버 미소장
90 Evidence of a lysosomal pathway for apoptosis induced by the synthetic retinoid CD437 in human leukemia HL-60 cells. 네이버 미소장
91 Role of gp91phox (Nox2)-Containing NAD(P)H Oxidase in Angiogenesis in Response to Hindlimb Ischemia 네이버 미소장
92 Diagnosis of bovine freemartinism by fluorescence in situ hybridization on interphase nuclei using a bovine Y chromosome-specific DNA probe 네이버 미소장
93 Production of goats by somatic cell nuclear transfer. 네이버 미소장
94 Cloned Transgenic Calves Produced from Nonquiescent Fetal Fibroblasts 네이버 미소장
95 Cat cloned by nuclear transplantation. Nature 2002, 415, 859. 미소장
96 Dogs cloned from adult somatic cells. 네이버 미소장
97 Nuclear reprogramming of cloned embryos produced in vitro 네이버 미소장
98 Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 2001, 293, 1093- 1098. 미소장
99 Diverse subtypes and developmental origins of trophoblast giant cells in the mouse placenta. Developmental Biology 2007, 304, 567-578. 미소장
100 Proteomic analysis of the extraembryonic tissue from cloned porcine embryos. 네이버 미소장
101 Protein profiles of bovine placenta derived from somatic cell nuclear transfer 네이버 미소장
102 Comparative proteomic analysis of human placenta derived from assisted reproductive technology. 네이버 미소장
103 Proteomic Analysis of Hypoxia-Induced Responses in the Syncytialization of Human Placental Cell Line BeWo 네이버 미소장
104 Prohibitin family members interact genetically with mitochondrial inheritance components in Saccharomyces cerevisiae. 네이버 미소장
105 Mammalian Prohibitin Proteins Respond to Mitochondrial Stress and Decrease during Cellular Senescence 네이버 미소장
106 Prohibitins act as a membrane-bound chaperone for the stabilization of mitochondrial proteins. 네이버 미소장
107 Prohibitin-1 maintains the angiogenic capacity of endothelial cells by regulating mitochondrial function and senescence. 네이버 미소장
108 Indirect detection of photosensitizer ex vivo 네이버 미소장
109 p53-induced up-regulation of MnSOD and GPx but not catalase increases oxidative stress and apoptosis. 네이버 미소장
110 The Mitochondrial Production of Reactive Oxygen Species: Mechanisms and Implications in Human Pathology 네이버 미소장
111 The balance between Cu,Zn-superoxide dismutase and catalase affects the sensitivity of mouse epidermal cells to oxidative stress. 네이버 미소장
112 DNA damage in telomeres and mitochondria during cellular senescence: is there a connection? 네이버 미소장
113 Oxidative stress shortens telomeres 네이버 미소장
114 Differential expression of apoptotic genes PDIA3 and MAP3K5 distinguishes between low- and high-risk prostate cancer 네이버 미소장
115 Proteomics-based identification of two novel direct targets of hypoxia-inducible factor-1 and their potential roles in migration/invasion of cancer cells. 네이버 미소장
116 Visualization of cell death in vivo with the annexin A5 imaging protocol 네이버 미소장
117 Tropomyosin 4 regulates adhesion structures and resorptive capacity in osteoclasts 네이버 미소장
118 Inhibition of angiogenesis and angiogenesis-dependent tumor growth by the cryptic kringle fragments of human apolipoprotein(a). 네이버 미소장
119 HSP27 regulates cell adhesion and invasion via modulation of focal adhesion kinase and MMP-2 expression 네이버 미소장
120 The translationally controlled tumour protein (TCTP) 네이버 미소장
121 Proton diffusion in the active site of triosephosphate isomerase. 네이버 미소장
122 Triosephosphate isomerase deficiency: Facts and doubts 네이버 미소장
123 Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle cloned embryos. 네이버 미소장
124 Endocrine characteristics of cloned calves. 네이버 미소장
125 Excess estrogen sulfoconjugation as the possible cause for a poor sign of parturition in pregnant cows carrying somatic cell clone fetuses. 네이버 미소장

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