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표제지

목차

Nomenclature 10

국문요약 11

1. 서론 13

1.1. 연구배경 13

1.2. 연구동향 14

1.3. 연구목적 16

2. 실험장치 및 방법 18

2.1. 고효율 현미경법(HTM) 개발 18

2.1.1. 석면시료 영상 획득을 위한 장치구성 18

2.1.2. 석면시료 영상 처리 및 분석 21

2.1.3. 장치 검증을 위한 정도관리시료와 현장시료 분석 28

2.2. 석면 부착 단백질을 이용한 백석면의 선택적 검출 30

2.2.1. 석면부착 단백질의 추출 30

2.2.2. 석면부착 단백질의 특성 확인 37

2.2.3. 형광현미경을 이용한 백석면 검출 37

2.3. 형광 HTM을 이용한 백석면의 선택적 자동 검출 38

2.3.1. 형광 영상 획득을 위한 HTM 장치 개선 38

2.3.2. 백석면의 형광 영상 분석 38

3. 결과 및 고찰 41

3.1. 석면섬유 영상 자동 분석 41

3.2. 정도관리시료와 현장시료 분석을 통한 검증 48

3.3. 실내공기시료 분석 및 분석 파라미터 최적화 51

3.4. 석면부착 단백질의 정제 61

3.5. 석면부착 단백질의 특성 검증 66

3.6. 형광 HTM을 이용한 백석면의 고효율 선택적 계수 71

4. 결론 76

참고문헌 77

Abstract 81

List of Tables

Table 1. A set of primer sequences. 32

Table 2. Comparison between phase contrast microscopy (PCM) andhigh-throughput microscopy (HTM) methods. 43

Table 3. Comparison of fiber concentration measured by PCM and HTM for PAT (Proficiency Analytical Testing) standard asbestos samples. 49

Table 4. Comparison of fiber concentration measured by PCM and HTM for on-site airborne asbestos samples. 50

Table 5. The concentrations of asbestos that resulted by image parameter variation. 58

Table 6. Comparison between results obtained using "Threshold" and "Auto Local Threshold 60

List of Figures

Fig. 1. Equipments for air sampling, procedure of sample preparation and a flow chart for PCM. 19

Fig. 2. (a) Schematic diagram of high-throughput microscopy (HTM) system and its parts. (b) A photo of HTM prototype. 20

Fig. 3. (a) Standard asbestos sample preparation using ball milling. (b) Three types of asbestos samples (chrysotile, amosite and crocidolite). 23

Fig. 4. Raw images of ball-mill ground asbestos samples. 24

Fig. 5. A photo of chrysotile images obtained by HTM device. 25

Fig. 6. Asbestos sample images undergone specific steps for image processing and analysis in HTM method 26

Fig, 7. (a) Hemocytometer. (b) Grid pattern inside the chamber. 27

Fig. 8. Sample slide for PCM analysis. 29

Fig. 9. Spectrophotometer for optical density measurement. 33

Fig. 10. Result of IPTG induction test. 34

Fig. 11. Photos of centrifuges. 35

Fig. 12. Results of protein purification. 36

Fig. 13. Schematic diagram of fluorescent high-throughput microscopy (HTM) system. 40

Fig. 14. Size of a field of view. 44

Fig. 15. Comparison of manual count and automatic image analysis on three types of asbestos 45

Fig. 16. Total fiber counts versus asbestos concentration affected by change in the parameter 46

Fig. 17. Comparison between manual count and automatic count in accordance with the variation of parameter sets. 47

Fig, 18. (a) Comparison of asbestos concentrations of indoor air samples resulted from HTM and PCM methods, (b) Comparison of asbestos concentrations of PAT standard samples analyzed by HTM and PCM. 67

Fig. 19. Principle of "Triangle" method. 54

Fig. 20. Processure of image analysis using "Threshold-triangle" method. 55

Fig. 21. Process of image analysis applying "Auto Local Threshold" varying 'threshold" and 'radius' values. 56

Fig. 22. The field-sample images with noisy background. From the first line, sample1. sample2. sample3, sample4 and sample5 analyzed in Table 6. Bar=100 μm. 57

Fig. 23. A flow chart for recombinant protein manufacturing 62

Fig. 24. Amplified DNA fragment followed by PCR using E.coli genomic DNA. 63

Fig. 25. Commercial kits for protein chromatography and dialysis 64

Fig. 26. Result of peptide mapping of the recombinant protein 65

Fig. 27. Verification for the properties of DksA adhered to chrysotile. 69

Fig. 28. Result of protein binding test on three types of asbestos. 70

Fig. 29. Comparison between specified number of microspheres and measured number of microspheres by modified HTM. 73

Fig. 30. Comparison of analyzed asbestos images between bright field image and fluorescence image. (a) Bright-field image of chrysotile, (b) Result after image analysis, (c) Fluorescence image of chrysotile and (d) Result after fluorescence image analysis. 74

Fig. 31. Results of asbestos fiber count obtained by HTM and PCM. 75

초록보기

석면은 내구성이나 내열성, 불연성 등의 우수한 특징으로 인하여 건축자재로 많이 사용되었지만 인체에 미치는 유해성으로 인해 세계보건기구(WHO)가 지정한 1급 발암물질이다. 특히 공기 중 석면은 호흡에 의해 체내에 축적되어 각종 호흡기 질환이나 폐암과 같은 치명적인 질병을 유발할 수 있으므로 석면에 노출되지 않도록 예방하는 것이 중요하며 이에, 석면 포함 가능성이 있는 자재 또는 공기 중에서 석면의 존재 여부를 파악하는 연구가 진행되고 있다. 현재 사용되고 있는 석면 검출방법으로는 위상차현미경법, 편광현미경법, 엑스선회절법, 전자현미경법 등이 있는데, 그 중 위상차현미경법(phase contrast microscopy; PCM)은 공기 중 석면의 검사법으로 검사방법이 비교적 간단하고 비용이 적게 들어 널리 쓰이고 있다. 그러나 작고 가는 섬유들은 위상차 현미경의 해상도 한계로 인해 검출하기 어려운 단점이 있고 검사자의 주관이 개입될 우려가 있다. 본 논문에서는 기존 위상차현미경법(PCM)을 자동화하기위한 영상 분석기반의 고효율 현미경법(high-throughput microscopy; HTM)을 개발하기 위하여 고효율 영상 획득 장치를 제작하고, 석면 농도를 단계별 희석한 표준시료를 이용하여 획득한 석면 영상에서 수동계수의 결과 값과 가장 일치하는 최적의 영상 분석 파라미터조합을 도출하였으며 이를 통해 섬유상 물질을 정량적으로 계수하였다. 도출된 최적의 파라미터 조합을 이용하여 표준시료와 고농도 현장시료, 저농도 실내공기시료에 대해 분석하고 이를 전문기관의 PCM 분석 결과와 비교하여 90% 이상의 일치성을 증명하였고 기존 방법 대비 10배 이상 분석 시간을 단축할 수 있었다. 또한, 국내에 높은 비율을 차지하고 있는 백석면을 선택적으로 검출하고자 재조합단백질 제조 기술을 이용하여 대장균에서 석면부착 단백질 DksA를 추출하고 이를 형광 염료와 결합하여 세 종류의 석면을 염색하였으며 이 중 백석면을 선택적으로 검출할 수 있음을 증명하였다. 형광염료와 결합한 단백질로 선택적 염색이 된 백석면을 고효율로 검출하기 위해 석면시료의 형광영상과 명시야 영상을 동시에 획득할 수 있도록 HTM 장치를 개선하였고 이를 통해 획득한 석면 영상을 분석하여 HTM의 감도와 선택성을 높일 수 있음을 확인하였다.

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