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ABSTRACT

Contents

1. Introduction 9

2. Materials and Methods 11

2.1. Sample collection 11

2.1.1. Liver tissue 11

2.1.2. Bile juice 12

2.1.3. Swine Feces 12

2.2. Elution buffer 12

2.3. Virus concentration 13

2.3.1. Polyethylene glycol (PEG) precipitation 13

2.3.2. Ultrafiltration (UF) method 14

2.4. RNA extraction 15

2.5. Nested reverse transcription-polymerase chain reaction 16

2.6. Realtime reverse transcription polymerase chain reaction 17

2.7. Sensitivity and Specificity of realtime RT-PCR 18

3. Results 21

Compared the sensitivity of realtime RT-PCR primer sets 21

Object for screening 21

Polyethylene glycol (PEG) precipitation 25

Ultrafiltration (UF) method 29

Measurement of the specificity of HEV for realtime RT-PCR primer 32

Recovery rate of HEV for realtime RT-PCR primer 34

4. Discussion 38

References 42

국문초록 48

List of Tables

Table 1. Sample size, elution buffer, concentration, and RNA extraction methods described in reference papers for the detection of hepatitis E virus in meats 19

Table 2. Oligonucleotide set designed in the ORF2-ORF3 over-lapping region for the detection of hepatitis E virus (HEV) by realtime RT-PCR 20

Table 3. Detection of hepatitis E virus in swine feces and bile juice nested RT-PCR and realtime RT-PCR 24

Table 4. Detection of hepatitis E virus in liver under the condition combination of elution buffers, concentrations, and detection methods 27

Table 5. Measurement for HEV recovery rate in realtime RT-PCR 36

List of Figures

Figure 1. Comparison of the sensitivity of realtime RT-PCR in swine fecal samples. 22

Figure 2. Mornitoring of HEV by realtime RT-PCR in fourty-five swine bile juice samples and seventy-nine fecal samples. 23

Figure 3. Comparison of phosphate-buffered saline (pH 7.4), 0.25M Threonine buffer(0.14M NaCl, pH 7.5) and 0.25M glycine buffer (0.14M NaCl, pH 7.5) to detect HEV by realtime RT-PCR with PEG concentration. 28

Figure 4. Comparison of phosphate-buffered saline (pH 7.4), 0.25M Threonine buffer (0.14M NaCl, pH 7.5) and 0.25M glycine buffer (0.14M NaCl, pH 7.5) to detect HEV by realtime RT-PCR with PEG concentration. 31

Figure 5. Specificity of realtime RT-PCR in two HEV positive samples and NoV, RoV, HAV, FCV, MNV samples. 33

Figure 6. Standard curve of quantitative realtime RT-PCR. 35

Figure 7. Comparison of viral concentration rate according to concentration method and the type of buffer for isolation and concentration. 37

초록보기

 본 연구의 목적은 육류에서 최적화된 E형 간염 바이러스 검출법을 개발하는 것이다. 세 가지 탈리 및 농축 용액과 두 가지 농축 방법을 각각 조합하여 realtime RT-PCR과 nested RT-PCR을 수행하여 HEV 검출률을 비교하였다. 26개의 돼지 간장 시료를 사용하여 realtime RT-PCR을 수행하였을 때에 phosphate buffered saline (pH 7.4) 용액과 ultrafiltration 농축 방법을 조합한 결과 6개의 양성 시료가 검출되었으며 PEG농축법을 사용한 결과 5개의 양성 시료가 검출되었다. 0.25M threonine buffer (0.14M NaCl, pH 7.5)용액으로 ultrafiltration 농축법과 PEG 농축법을 조합하였을 때에 각각 3, 1개의 양성 시료가 검출되었으며, 0.25M glycine buffer (0.14M NaCl, pH 7.5) 용액으로 두 가지 농축법을 조합하였을 때에는 각각 1, 3개의 양성 시료가 검출되었다. Nested RT-PCR을 수행한 결과, 탈리 및 농축 용액의 종류와 농축 방법과는 상관없이 양성 시료가 거의 검출되지 않았다. 따라서 식육에서 HEV를 검출함에 있어 phosphate buffered saline (pH 7.4) 용액과 ultrafiltration 농축법을 조합하여 realtime RT-PCR을 수행하였을 때에 특이도와 민감도가 가장 높았음을 알 수 있었다.

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