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Contents

ABSTRACT 8

I. Introduction 10

II. Materials and Method 14

1. Plant materials 14

2. Vector construction and detection 14

3. Agroinfiltration and detection 15

4. Detection of the GFP and EPO by western blot analysis 16

5. Protein purification in potato leaf 17

III. Results and Discussion 19

1. GFP gene expression using Agrobacterium-mediated transient system in plant and transient system optimization 19

A. GFP gene expression in N.benthamiana 19

B. GFP gene expression by transient system in Potato (Solanum tuberosum l. cv Desiree) 29

2. EPO gene expression and overexpression using Agrobacterium-mediated transient system in plant 31

A. EPO gene expression in N.benthamiana 31

B. EPO expression in potato(Solanum tuberosum l. cv Desiree) using Agrobacterium-mediated transient system 36

IV. Conclusion 43

V. Reference 45

논문요약(국문) 53

List of Figures

Fig. 1. Schematic representation of the T-DNA binary vectors used in this study. (A) The TEV::GFP was used for transient GFP expression. e35S pro: double CaMV 35S promoter, NPTII: neomycin phosphotransferase gene, 35s ter: CaMV 35s gene terminator, TEV: tobacco etch virus translational enhancer,... 21

Fig. 2. Analysis of GFP expression level in leaves infiltrated with A. tumefaciens harboring TEV::GFP (pCambia2300) and pMBPsmGFP and pMBP vector. (A) Leaves were observed under a microscope equipped with white light (○) at 5 days post infiltration (dpi) and under a UV light at 2, 3, or 5 dpi. (B) Western...(이미지참조) 23

Fig. 3. GFP expression level comparison by agroinfiltration number of times. (A) GFP expression level of agroinfiltration number of times under the UV light. From the upper lefth and corner. ; 1. N.C: Infiltrated of infiltration buffer ; 2. TEV::GFP 1-2times infiltration ; 3. TEV::GFP 3times infiltration ; 4. TEV::GFP... 25

Fig. 4. GFP expression according to the density of the Agrobacterium suspension used for infiltration. Western blot analysis results of GFP expression level by agrobacterium concentration(OD600) in 5d.p.i N.benthamiana leaf sample. TSP: 25ug. Red arrow was showed the 27kDa GFP protein band. N: Infiltrated...(이미지참조) 26

Fig. 5. GFP expression level with CMV2b suppressor using agroinfiltration in 5 days post infiltration N.benthamiana leaf. (A) SDS-PAGE analysis results of GFP expression level with CMV2b suppressor. ; (B) GFP expression level comparison graph of infiltration number of times with CMV2b suppressor based... 28

Fig. 6. Western Blot analysis results of GFP expression in Potato leaf using agroinfiltration. (A) The sample were used 3 dayspost Agroinfiltration. TSP: 100ug.. anti-GFP antibody 1:1000 ; (B) GFP expression comparison of Potato species. Desiree : Solanum tuberosum, N.C: Infiltration buffer. 2 and 4 samples... 30

Fig. 7. pEarleyGate vector map. (A) (Earley et al. 2006). pEarleyGateVector backbone. (B) pEarleyGate101EPO, pEarleyGate103EPO, pEarleyGate205EPO map. 33

Fig. 8. YFP Protein localization of EPO using pEarleyGate101EPO by confocal microscope. WT: negative control. non-transgenic N.benthamiana.; pMBP: pMBP vector. ; EPO: pEarleyGate101EPO. 5 day post-infiltration leaf. ; the upper-right-hand corner: only epidermal cell well. ; the lower-left-hand corner: YFP... 34

Fig. 9. EPO expression level comparison with suppressor using agroinfiltration in N.benthamiana leaf. (A) SDS-PAGE analysis results of GFP and EPO expression in 5days post-infiltration N.benthamiana leaf with CMV2b suppressor. N: negative control, infiltration buffer. T.G: TEV::GFP. 103E:... 38

Fig. 10. SDS-PAGE analysis of EPO and GFP TSP were extracted using TCA-Acetone method. Red arrow were the predicted truncated GFP protein and EPO protein. Peptide sequencing results, these bands were not target protein. 41

Fig. 11. EPO expression using Agrobacterium-mediated transient system in 3dpi potato leaf. After EPO-GFP-6x his fusion protein purification, the membrane was subjected to immunoblotting analysis with primary anti-EPO antibody and primary anti-GFP antibody for each membrane. The each results, EPO-GFP... 42

초록보기

Erythropoietin (EPO)는 mammals에서 red blood cell의 형성을 조절하는 당 단백질 호르몬이다. 이 물질은 또한 뉴런의 상처의 뇌의 반응과 상처 치료 과정에서 중요한 역할을 하는 생물학적 기능들이 알려져 있다. 담배（N.benthamiana)에서 사용하는 식물 형질전환 기술 중에서 잘 알려진 Agrobacterium을 이용한 transient 형질전환 기술을 이용하여 N.benthamiana에서 GFP를 발현 시켰다. 또한, agroinfiltration의 횟수, agrobacterium 농도 (OD600 값) 그리고 suppressor(CMV2b)에 의하여 GFP를 과발현 정도를 확인하였다. 그 결과, 오직 suppressor를 이용한 GFP 발현에서만 발현 정도가 상승하였다. 이것은 agroinfiltration 횟수와 agrobacterium 농도에서는 PTGS에 의해 발현이 제한되고 이 PTGS를 suppressor가 억제 시켜 외부 유전자의 mRNA의 감소를 막아 translation이 더울 활발하게 일어났다는 것을 의미한다. 이 방법을 식물에서 재조합 humanEPO (rhEPO) gene을 과발현을 유도하기 위해 적용하였다. Western blot 분석에서 Agrobacterium을 이용한 transient 방법을 사용하여 suppressor를 적용시켜 rhEPO를 발현 시켰을 때, suppressor를 적용시키지 않은 rhEPO 발현 정도보다 약 5.5배 발현율이 증가 하였다. 이 사실을 바탕으로 rhEPO를 transient system을 이용하여 중요한 세계 3대 작물인 potato (Solanum tuberosum l. cv Desiree)에서의 발현을 시도하였다. 단백질 정제과정을 거친 후 western blot 분석에서 비록 N.benthamiana에서의 rhEPO 발현양에는 미치지 못하지만, potato에서도 Agrobacterium을 이용한 transient 방법에 의하여 rhEPO의 발현 유도가 가능했다.

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