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Title Page 1

Contents 3

ABSTRACT 7

1. INTRODUCTION 8

2. MATERIALS AND METHODS 10

2.1. Materials 10

2.2. Experimental 10

2.2.1. Isolation and identification of chitinolytic bacterium 10

2.2.2. Composition of medium 11

2.2.3. Determination of chitinase activity 12

2.2.4. Gel electrophoresis and activity staining of chitinase 12

2.2.5. Effect of metal ions on chitinase activity 13

2.2.6. Partial purification of chitinase 13

3. RESULTS AND DISCUSSION 15

3.1. Identification of chitinolytic bacterium 15

3.2. Cell growth and chitinase activity 18

3.3. Expression pattern of chitinase isozymes with different culture medium 20

3.3.1. LB medium and chitin medium 20

3.3.2. CSC, SPC, and CSP medium 22

3.3.3. Three different culture medium and effect of yeast extract source 24

3.4. Expression pattern of Native-PAGE isozymes on SDS-PAGE 27

3.5. Inhibition of metal ions for crude enzyme 29

3.6. Partial purification of chitinase 31

4. CONCLUSIONS 33

5. REFERENCES 34

국문 초록 38

List of Tables 5

Table 1. Composition of different chitin medium 11

Table 2. Effects of metal ions on activity of chitinase from P. chitinolyticus MP-306 29

List of Figures 5

Figure 1. Strain MP-306 showed halo formation around colonies on 0.5% colloidal chitin... 16

Figure 2. 16S rRNA gene sequence of the isolated MP-306. Paenibacillus chitinolyticus... 17

Figure 3. Phylogenetic tree of 16S rRNA from the isolated MP-306 17

Figure 4. Time course of cell growth (-￮-), protein contents (-∙-), and chitinase activity of P.... 19

Figure 5. Changes of chitinase activity of P. chitinolyticus MP-306 on native-PAGE (A) and... 21

Figure 6. Expression patterns of chitinase produced from Paenibacillus chitinolyticus MP-... 23

Figure 7. Expression patterns of chitinase produced from Paenibacillus chitinolyticus MP-... 25

Figure 8. Expression patterns of chitinase produced from Paenibacillus chitinolyticus MP-... 26

Figure 9. Chitinase activity of P. chitinolyticus MP-306 on 2-D native/native-PAGE gel [A... 28

Figure 10. Chitinase activity of P. chitinolyticus MP-306 with different metal ions on native-... 30

Figure 11. Chitinase activity of P. chitinolyticus MP-306 after chitin-affinity chromatography... 31

Figure 12. Chitinase activity staining of P. chitinolyticus MP-306 after chitin-affinity... 32

초록보기

 키틴배지와 LB배지에서 배양한 페니바실러스 키티노리티쿠스 MP-306을 native-PAGE와 SDS-PAGE 겔 상에 키틴분해 동질효소의 발현 양상을 조사하였다. 페니바실러스 키티노리티쿠스 MP-306은 콜로이드 키틴배지 상에서 키틴분해력이 강했다. MP-306의 키틴분해 동질효소는 native-PAGE에서 6개의 활성밴드를 (CN1-CN6) 발현 하였다. 또한 SDS-PAGE 상에서는 13개의 (CS1-CS13)의 동질효소를 발현하였다. LB배지에서 키틴분해효소 발현에 영향을 주는 요소는 효모 추출물인 것으로 나타났다. 오징어 연골 유래 키틴 배지(SPC)에서 게껍질 키틴배지(CRS)와 매미허물 키틴배지(CSP)보다 상대적으로 강한 활성을 보였다. 탄산칼슘이 제거되지 않은 게껍질 분말을 사용한 배지(CSR)에서는 키틴분해효소 발현 정도가 낮았으며, 탄산칼슘이 제거된 배지(CPC)에서는 강한 활성을 보였다. CN1, CS6 동질효소가 가장 먼저 발현되며, CN5, CS7, CS8의 동질효소가 다음 순으로 발현되는 특징을 보여주었다. 키틴배지에서 배양한 MP-306은 native-PAGE 상에서 발현된 CN1, CN2, CN3 동질효소는 SDS-PAGE상에서 CS1, CS2, CS3, CS4, CS5, CS6, CS8, CS10으로 발현되는 특징을 가지고 있다. MP-306의 키틴 분해 동질효소 중 CN4, CN5, CN6는 native-PAGE와 SDS-PAGE 겔 상에서 금속이온에 대해 상대적으로 저해를 강하게 받았다. 키틴 친화력 정제 결과 CN5 동질 효소는 키틴에 대해 결합력이 약했다. CS6는 중성의 버퍼에서 용출되었으며, CS8은 pH 3.2에서 용출되는 특징을 보여주었다.

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