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Title Page

ABSTRACT

Contents

Abbreviations 11

Introduction 12

Neurological disorders 12

Motivation 16

Summary of research 17

Genomics layered approach: construction of an integrated genetic information database for a neurological disorder 20

Introduction 20

Materials and Methods 21

Data source and processing 21

Pathway analysis 25

Database implementation 25

Results 27

User Interface 27

Discussion 36

Functional genomics layered approach: development of a siRNA design algorithm considering alternative splicing 37

Introduction 37

Methods 40

Evaluation of a common target region 40

Rules for siRNA selection and efficiency scoring 41

Implementation 44

Input and input options 44

Output 48

Data and used tools 48

Performance of designed siRNAs 49

Conclusion 57

Epigenomics layered approach: Study on the epigenomic role of the DNA methylation and hydroxymethylation during neuronal cell differentiation 58

Introduction 58

Materials and methods 61

Differentiation of hES cells 61

qRT-PCR 61

5hmC and 5mC quantification 61

Expression analysis 61

hMeDIP-seq and MBD-seq 61

BS and TAB-Seq 63

Gene expression-dependent 5hmC and 5mC density analysis 63

DMR and DhMR identification and annotation 64

Data deposition into public sequence database 64

Results 65

Profiling of the DNA methylome, hydroxymethylome and transcriptome during neural differentiation of hES cells 65

Differentially hydroxymethylated or methylated regions associated with neural differentiation 65

Analysis of 5hmC and 5mC occurrence associated with gene expression 72

Gene body hydroxymethylation in genes up-regulated during neural differentiation 75

DNA methylation as a locking mechanism to maintain gene silencing 80

Discussions 83

Conclusion 85

References 87

Summary 97

Curriculum Vitae 100

List of Tables

Table 1. Hierarchical classification structure of neurological disorder 13

Table 2. Distribution of the cerebrovascular disease cases in western and Korean society 15

Table 3. 11 main etiologies of stroke selected for SigCS base 23

Table 4. Keywords used to retrieve OMIM database for stroke and its etiology related records 24

Table 5. Statistics on the information in SigCS base 29

Table 6. Summary of the performance of siRNAs for 5 gene families from gene silencing experiments 51

Table 7. Gene silencing experiment results by siRNA transfection targeting NFKB family genes 52

Table 8. Primers for qRT-PCR, BS and TAB-Seq 62

List of Figures

Figure 1. Two main types of cerebrovascular diseases as a typical brain disease 14

Figure 2. Multi-factorial interactions result in cerebrovascular diseases 18

Figure 3. Three layered approaches for data-driven analysis of genomic factors and gene expression for neurological disorder study 19

Figure 4. Construction flow for SigCS base 22

Figure 5. Statistical test for assignment of significantly overlapping biological pathways cerebrovascular disease and its etiology related gene sets 26

Figure 6. Screenshot of the main web page of the integrated genetic information database for human cerebral stroke, SigCS base 28

Figure 7. Information flow in the retrieval system of the SigCS base 30

Figure 8. Screenshots of the user interface for the two principal search flows in SigCS base 31

Figure 9. Screenshots of the detailed variant information windows of a selected gene 33

Figure 10. Screenshots of the secondary linked detailed information windows for a selected gene 34

Figure 11. Schematic diagrams of siRNA design flow for functional studies of neurological disorder related genes 39

Figure 12. Schematic diagrams for evaluating a target region to design siRNAs 42

Figure 13. Schematic diagram of a data processing flow for siRNA design in AsiDesigner 45

Figure 14. Screenshots for the siRNA design procedure in AsiDesigner 46

Figure 15. Results of gene silcncing experiments for two altcrnative isoforms, Bcl-xL (NM_138578) and Bcl-xS (NM_001191) of human BCLX (BCL2L1) gene by RT-PCR 50

Figure 16. Flow for the analysis of the epigenomic role of the DNA hydroxymethylation and DNA methylation during the differentiation of the human stem cell to brain (dopamine neuron) cell 60

Figure 17. In vitro model system of differentiation of hES cells into NP cells and terminally into DA neurons 67

Figure 18. Correlation of expression, DNA methylation, and hydroxymethylation before and after differentiation 69

Figure 19. Characterization of DhMRs and DMRs within the hMeDIP-seq and MBD-seq data 71

Figure 20. Genomic browser representation of chromatin signatures 73

Figure 21. Gene expression-dependent 5hmC and 5mC densities in hES cells and NP cells 74

Figure 22. Up-regulated genes that gained 5hmC in the gene body or lost 5mC in the promoter or gene body 76

Figure 23. Distribution of 5hmC and 5mC densities in NOTCH1, RGMA and AKT1 78

Figure 24. Test result for efficiency of BS and TAB-Seq 79

Figure 25. heatmaps of 5hmC/5mC and expression of the promoter-methylated genes during neural differentiation of hES cells 81

Figure 26. Characterization of the promoter-methylated genes during neural differentiation of hES cells 82

초록보기

 뇌질환 또는 신경계 질환은 광범위한 신경계의 구조적, 생화학적 또는 전기적 비정상에 의한 복잡한 신경계 관련 질병으로서 뇌혈관 질환이나 파킨슨병을 포함한다. 그 중 뇌혈관질환은 다양한 유전적 소인 및 환경적 위험 요소와 원인 질병들간의 복잡한 상호작용에 의해 뇌혈관이 막히거나 파열되어 발생하며, 파킨슨병은 중뇌 영역에서 주로 도파민 생산 관련 신경세포들의 사멸에 의해 발생하는 퇴행성 뇌질환으로서, 발병 원인과 기작 연구에 상당한 어려움이 있다. 뇌질환의 분자적 기작을 효과적으로 연구하고, 치료에 적용하기 위해서는 산발적으로 연구 보고되고 있는 뇌질환 관련 유전적 변이, 유전자 기능 및 관련 정보들을 체계적으로 종합하여 연구자들에게 제공할 수 있는 유전정보 데이터베이스와 다양한 생물정보학적 도구들의 지원이 필요하다. 또한, 뇌질환의 근본적 원인치료를 위해서 뇌세포의 정상적 분화와 활동과정에 있어서 후성학적 발현조절에 관한 이해가 선행되어야 하며, 유전체학, 기능유전체학, 후성유전체학을 포함하는 다차원적 연구가 종합적으로 수행되는 것이 효과적일 것이다. 본 연구에서는, 뇌혈관 질환 관련 유전 변이 정보, 엑손 구조정보, 차세대 서열분석 기술을 적용하여 구한 DNA 메틸화와 수산화메틸화 단편서열 정보를 기반으로 뇌혈관 질환 유전변이 정보 데이터베이스를 구축하고, 유전체 기능연구 지원을 위한 새로운 siRNA 설계 도구를 개발하며, 뇌세포 분화과정에서 DNA 메틸화와 수산화메틸화의 후성학적 역할을 고찰 함으로써, 뇌질환의 유전적 원인과 병리기작 이해를 위한 유전학, 기능 유전체학 및 후성유전체학적 요인 연구를 생물정보학 측면에서 지원하고자 하였다.

첫째, 유전체학적 측면의 뇌질환 연구지원을 위하여 뇌혈관 질환 종합 유전정보 데이터베이스를 개발하였다. 현재까지 보고된 뇌혈관 질환과 병인들에 대한 유전적 변이, 유전자 정보, 기능주석, 표현형, 문헌 정보들을 공개 데이터베이스들로부터 추출하여 정리하였으며, 생물학적 경로를 분석하여, 관계형 데이터베이스로 구축하고, 웹 검색시스템을 구현하였다. 뇌혈관 질환과 병인들에 연관된 것으로 보고된 유전정보들을 효과적으로 검색할 수 있으며, 신규 연구대상 유전자의 선택, 연구중인 유전적 변이들의 동정, 병리적 기작관련 생물학적 경로 검색 등의 지원을 통하여 뇌혈관 질환의 원인과 분자생물학적 병리기작 연구를 효과적으로 지원할 수 있다. 현재 뇌혈관 질환과 병인 관련 1,943 종의 유전자들과 유전 변이 정보, 그리고 이들을 기반으로 분석한 165 종의 생물학적 경로가 저장되어 있다.

둘째, 기능유전체학적 측면에서 뇌질환 연관 유전자들의 기능연구를 돕기 위한 생물정보학적 도구로서, 선택적 스플라이싱을 고려한 siRNA 설계 알고리즘을 개발하였다. 뇌질환 관련 유전자들의 기능을 구체적으로 연구할 수 있도록 특정 발현체 또는 발현체들의 조합에 대하여 발현을 억제할 수 있는 siRNA 를 설계할 수 있으며, 설계된 siRNA 들의 성능예측을 위하여 현재까지 알려진 주요 성능관계 변수들 중 통계적 연관성을 기반으로 선정한 5 종의 요소들에 대하여 가중치를 적용한 성능 예측 모델을 고안하여 적용하였고, 유전자 발현 억제 실험을 통하여 성능을 확인하였다. 인간은 물론 2 종의 모델 생물에 대한 siRNA 설계를 지원하도록 구현하여, 뇌질환 연관 후보 유전자들의 기능을 발현체 수준에서 정밀하게 연구할 수 있는 기반을 마련하였다.

셋째, 줄기세포 기반의 뇌질환 치료연구에 있어서 후성유전체학적 측면의 기반 지식을 확보하기 위하여, 뇌세포 분화과정에서 DNA 시토신 염기의 메틸화 및 수산화메틸화와 유전자 발현과의 관계를 도파민 신경세포의 분화과정을 통한 in vitro 모델을 이용하여 차세대 염기서열 분석기술을 기반으로 분석하였다. 신경세포의 분화과정에서 DNA 메틸화와 수산화메틸화의 패턴이 전장 유전체 차원에서 심한 변화를 보였으며, DNA 메틸화는 주로 유전자의 프로모터와 액손, 그리고 인핸서 영역에서 크게 변화 하였고, 수산화메틸화는 유전자 본체 영역의 변화가 유전자의 활성화에 기여하는 것을 확인하였다. 분화과정에서 신경발달 관련 유전자인 NOTCH1, RGMA, AKT1 등이 유전자 본체 영역에서 수산화메틸화가 이루어지면서 발현이 증가하였고, 줄기세포의 분화능 관련 유전자들인 POU5F1, ZFP42, HMGA1 등은 프로모터 영역의 메틸화를 통하여 발현이 억제되었다. 또한, 줄기세포에서 이미 발현이 억제되어 있는 중배엽 분화 관련 유전자들인 NKX2-8, TNFSF11, NFATC1 등이 신경세포로의 분화 과정에서 메틸화를 통하여 발현이 잠기는 현상을 확인하였으며, 분화에 따른 발현 변화 유전자들을 이용한 생물학적 경로분석을 통하여 뇌세포 분화 과정에서 DNA 의 메틸화와 수산화 메틸화가 분화관련 유전자들의 발현 조절에 후성학적으로 기여하면서 주도적 역할을 하고 있음을 확인하였다.

본 연구를 통하여 구현된 뇌혈관 질환 관련 종합 유전정보 데이터베이스와 선택적 스플라이싱을 고려한 siRNA 설계 알고리즘은 뇌질환 관련 유전정보를 검색 및 비교하고, 연구 대상 유전자를 선택하거나, 연구를 통하여 밝혀진 유전적 변이의 병리학적 기여를 기능적으로 연구하는데 있어서 효과적인 도구로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 인간 배아 줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화과정 연구에서 얻은 DNA 메틸화와 수산화메틸화의 유전자 발현조절 관련한 발견은 인간 배아발달 과정에서 뇌조직의 분화에 있어서 분자적 기작 연구에 도움을 줄 수 있을 것이며, 나아가 줄기 세포를 이용한 뇌질환 치료 연구에 있어서 뇌조직 회복의 분자적 기작 연구에 중요한 기반지식이 될 수 있을 것이다.

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