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Title Page

Abstract

Contents

1. Introduction 14

1.1. Aspergillus nidulans life cycle 14

1.2. Autolysis 18

1.2.1. What is autolysis? 18

1.2.2. Autolysis and cell wall 18

1.2.3. Autolysis and development 19

1.3. Apoptosis 21

1.3.1. What is apoptosis? 22

1.4. Previous research on potential homologs of MsnA in fungi 24

1.4.1. Saccharomyces cerevisiae MSN2/MSN4 24

1.4.2. Candida albicans msn4 and mnl1 26

1.4.3. Candida glabrata msn2 27

1.4.4. Yarrowia lipolytica mhy1 28

1.4.5. Aspergillus fumigatus sebA 28

1.4.6. MsnA in Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus 29

1.4.7. Aspergillus niger msnA 30

1.4.8. Talaromyces (Penicillium) marneffei hgrA 31

1.4.9. Trichoderma atroviride seb1 31

1.5. Significance and objectives of this research 32

2. Materials and Methods 34

2.1. Strains 34

2.2. Media and Growth condition 35

2.2.1. Aspergillus nidulans 35

2.2.2. Escherichia coli 37

2.3. Molecular techniques 38

2.3.1. Aspergillus nidulans 38

2.3.2. Escherichia coli 49

2.4. Construct design for the overexpression strains 50

2.5. Generation of deletion mutants 50

3. Results 55

3.1. Identification of A. nidulans msnA 55

3.2. MsnA is required for vegetative growth 59

3.3. The role of MsnA in adaptation to stress conditions 64

3.4. MsnA is involved in response to glucose depletion 66

3.5. MsnA is important for autolysis 68

3.6. Overexpression of msnA represses asexual development 73

3.7. MsnA is required for flbA-dependent autolysis 77

3.8. Loss of pkaA suppresses autolysis in the msnA overexpression strain 82

3.9. MsnA and PkaA independently regulate growth and development 84

3.10. Overexpression of pkaA induced swelling of conidia and hyphae 87

3.11. Deletion of msnA did not suppress phenotype of the pkaA overexpression strain 91

3.12. MsnA and PkaA are required for cell wall integrity 93

3.13. ExgO is a transcriptional target of MsnA and important for autolysis 95

3.14. Conclusion 104

4. Discussion 106

5. Reference 110

6. 한글초록 119

7. Resume 121

8. Supplementary material 122

List of Tables

Table 1. List of Aspergillus nidulans strains 34

Table 2. Hutner's trace element solution 36

Table 3. 20X Salt solution 37

Table 4. Vitamin solution 37

Table 5. E. coli strain 37

Table 6. LB media 38

Table 7. 10x RNA loading buffer 40

Table 8. 5x RNA loading buffer 40

Table 9. RNA loading gel 41

Table 10. 20x SSC buffer 41

Table 11. Protoplast buffer 43

Table 12. 0.6M KCl buffer 43

Table 13. PEG buffer 43

Table 14. Lysis buffer I 46

Table 15. TNE buffer 47

Table 16. SOA 49

Table 17. SOC 49

Table 18. Oligonucleotides used in this study 51

Table 19. Cell wall compositions of △msnA and △pkaA 95

List of Figures

Figure 1. Schematic representation of the chromatin immune-... 47

Figure 2. MsnA and its homologs in fungi 58

Figure 3. Transcription of msnA during A. nidulans life cycle 59

Figure 4. Generation of a msnA deletion mutant 63

Figure 5. Resistance of △msnA to various stress conditions 65

Figure 6. Extracellular protease production of △msnA 67

Figure 7. Sexual development of △msnA in low glucose conditions 68

Figure 8. The role of MsnA in autolysis in A. nidulans 72

Figure 9. The role of MsnA in conidiophore development 75

Figure 10. Binding of MsnA to the brlA promoter 77

Figure 11. Autolysis induced by msnA overexpression 79

Figure 12. The roles of MsnA in FlbA-induced autolysis and... 81

Figure 13. The role of PkaA in MsnA-induced autolysis 84

Figure 14. Vegetative growth of △pkaA;△msnA 87

Figure 15. Phenotype of the pkaA overexpression strain 90

Figure 16. Hyphal morphology of △msnA;alcA(p)::pkaA 93

Figure 17. Sensitivity of △msnA and △pkaA to cell wall disturbing... 95

Figure 18. Expression of exgO in the msnA mutants 98

Figure 19. Binding of MsnA to the exgO promoter 99

Figure 20. Phenotypes of △exgO 100

Figure 21. Overexpression of exgO 102

Figure 22. Effect of msnA deletion in exgO overexpression-induced... 104

Figure 23. A current model of the MsnA functions in A. nidulans 104

Figure 24. Effect of a PKA site mutation on MsnA-dependent... 109

Figure S1. Transcriptome analysis of genes involved in the... 122

초록보기

 Aspergillus nidulans 에서 자가분해는 탄소원의 결핍과 성장 신호 물질의 복합적인 조절에 의해 유도되는 자가 분해과정이다. 자가분해는 곰팡이의 세포 주기 동안 일반적으로 일어나는 현상으로 자가분해 과정의 생물학적 기능은 크게 알려진바 없다. 본 연구에서는 A. nidulans 의 전사인자 msnA의 자가분해과정에서의 기능을 살펴보았다. MsnA 유전자의 과대발현은 RGS 단백질 flbA의 결핍돌연변이체와 유사한 자가분해 현상을 보였으며, △flbA 균주에서 msnA 유전자의 결손은 자가분해를 억제하는 효과를 가져왔다. 이를 통해 msnA가 flbA 유전자의 하위에서 자가분해를 조절하고 있음을 확인할 수 있었다.

MsnA 결손 돌연변이체는 세포의 성장과 자가분해를 제한하며 과발현시 무성분화를 억제한다. ChIP 분석을 통해 MsnA가 무성분화의 주요 인자인 brlA의 프로모터에 결합하는 것이 확인되었고, 이는 MsnA에 의한 brlA의 직접적인 조절을 통해 무성분화를 억제하고 있음을 나타낸다.

cAMP-dependent protein kinase A인 PKA는 A. nidulans의 분화과정에서 FlbA/FadA 신호 경로에 부분적으로 관여하고 있음이 알려진 바 있다. 따라서 msnA에 의한 자가분해현상이 pkaA에 의해 조절되는지를 알아보고자 하였다. MsnA과대발현 균주에서 발생하는 자가분해현상은 PkaA 유전자의 결손으로 인해 저해되었으며, PkaA의 과대발현도 자가분해를 유도하는 것으로 보아 MsnA와 PkaA가 자가분해과정에서 일직선 상에 존재한다고 판단되었다. 또한 PkaA의 과대발현에 따른 자가분해 현상이 msnA 유전자의 결손에도 저해되지 못하며, PkaA의 프로모터 부분에 MsnA의 결합예상 부위인 STRE site가 존재하여 msnA가 pkaA의 상위에 존재함을 유추할 수 있었다.

MsnA와 PkaA가 자가분해 유도과정에서 동일선상에서 조절되는 반면, 세포의 성장과 세포벽 유지과정에서는 독립적인 조절양상을 보였다. △pkaA;△msnA 돌연변이는 △pkaA와 △msnA 각각의 돌연변이체보다 더 심각한 성장저해를 보여 이는 MsnA와 PkaA가 다른 과정을 통해 독립적으로 성장을 조절하고 있음을 나타내고 있으며, 또한 △pkaA와 △msnA 둘 다 세포벽내 glucan과 chitin의 생성을 저해하고 있지만 △pkaA와 △msnA는 세포벽 교란 물질인 Calcofluor white (CFW)에서 서로 다른 민감도를 보였다. 즉 △msnA의 경우 야생주에 비해 CFW에 저항성이 높은 반면, △pkaA는 매우 민감성을 보였다.

자가분해 과정은 세포벽의 분해와도 밀접하게 연관되어 있어 β-1,3-exoglucanase exgO 유전자의 발현양상을 조사하였다. 자가 분해를 유도하는 msnA 과대발현 균주에서 exgO 유전자의 발현이 높게 증가되는 것이 확인되었고 MsnA가 exgO 유전자의 프로모터에 결합하는 것이 ChIP분석을 통해 확인되었다. ExgO 유전자의 과대발현 또한 msnA의 과대발현 균주와 마찬가지로 자가분해 현상을 보였고, 이러한 현상은 msnA의 결손으로 억제되었다. 반면 exgO 유전자의 결손은 MsnA 과대발현에 의한 자가분해를 막지 못했으며, 이는 exgO 유전자가 msnA의 타겟이긴 하나 이는 부분적으로 기능이 중복되어 나타나는 현상으로 판단된다. 결론적으로 msnA는 pkaA와 exgO의 조절을 통해 자가분해 과정을 조절하였으며, 그 외 세포성장과 세포벽 조절과정은 msnA와 pkaA가 독립적으로 조절하고 있는 것으로 확인되었다.

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