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Title Page

Contents

List of abbreviation 9

Abstract 11

1. Introduction 13

1.1. Atherosclerotic plaques vulnerable and rupture 13

1.2. Analysis of the serum proteomics in acute coronary syndrome (ACS) 14

1.3. Fetuin protein 15

1.4. TGF-β receptor mediator p-Smad2/3 signaling in acute coronary syndrome (ACS) 16

1.5. The function and regulation of PAI-1 and MMP-2 in acute coronary syndrome (ACS) 17

1.6. Aim of the study 20

2. Materials and Methods 21

2.1. Materials 21

2.2. Patients and specimens 21

2.3. Protein isolation and identification 24

2.4. Cell migration measurement 25

2.5. Western blotting 26

2.6. Apoptosis assay 27

2.7. Oil red O staining 28

2.8. Flow cytometry analysis 28

2.9. Animal surgery and immunostaining 29

2.10. Quantitative real-time PCR 31

2.11. ChIP assay 32

2.12. Immunofluorescence 33

2.13. Boyden chamber assay 33

2.14. Wound-healing assay 34

2.15. Statistical Analysis 34

3. Results 35

3.1. Proteomic profiling of AMI for biomarker discovery 35

3.1.1. Clinical baseline and protein isolation 35

3.1.2. Identification of proteins in the serum from AMI or SA patients. 37

3.1.3. Validation of proteins expression in serum from AMI or SA patients 44

3.2. Functions of fetuin-B in atherosclerotic plaque rupture related cells 49

3.2.1. Effects of recombinant human fetuin-B protein on monocyte functions 49

3.2.2. Effects of recombinant human fetuin-B protein on macrophage functions 51

3.2.3. Effects of fetuin-B treatment on apoptosis in vascular smooth muscle cells 53

3.2.4. Effects of fetuin-B treatment on migration in hMSCs 55

3.2.5. Effects of fetuin-B treatment on differentiation in hMSCs 57

3.3. Signal pathway of fetuin-B-induced response in smooth muscle cells 60

3.3.1. Effect of fetuin-B on vascular smooth muscle cells viability 60

3.3.2. Measurement of PDGF-BB-induced fetuin-B production in vascular smooth muscle cells 62

3.3.3. Fetuin-B-induced phosphorylation of Smad2 and Smad3 in vascular smooth muscle cells 64

3.3.4. Fetuin-B-induced nuclear translocation of phosphorylated Smad2 and phosphorylated Smad3 in vascular smooth muscle cells 66

3.3.5. SB431542 blocked the effect of fetuin-B on intracellular Smad2 and Smad3 phosphorylation 68

3.3.6. SB431542 blocked the effect of fetuin-B on intracellular p-Smad2/3 nuclear translocation 70

3.3.7. Effects of fetuin-B on histone modification and PAI-1 and MMP-2 expression 72

3.3.8. Effects of fetuin-B treatment on migration in vascular smooth muscle cells 75

3.4. Effects of in vivo administration of fetuin-B on plaque stability in mice 77

4. Discussion 79

4.1. Proteomic profiling of AMI for biomarker discovery 79

4.2. Function of fetuin-B in atherosclerotic plaque rupture related cells 80

4.3. Signal pathway of fetuin B in smooth muscle cell 83

5. Conclusion 86

References 88

Abstract (in Korean) 99

List of Tables

Table 1. Clinical baseline characteristics of the study groups. 23

Table 2. Summary of proteins predominantly expressed serum proteins of AMI... 39

Table 3. Identification of differentially expressed serum proteins between acute... 46

List of Figures

Figure 1. Representative silver-stained 2-DE images of protein expression in... 36

Figure 2. Representative silver-stained 2-DE images of protein expression in the... 38

Figure 3. Pie chart showing the distribution of the proteins identified between... 43

Figure 4. Enlargement of silver-stained 2-DE images with up- and down-... 45

Figure 5. Validation of the expression of fetuin proteins in serum from patients... 48

Figure 6. Effects of fetuin-B on migration and MMP-2 activation in U937... 50

Figure 7. Effects of fetuin-B on RAW264.7 cell responses. 52

Figure 8. Effects of fetuin-B on vascular smooth muscle cell responses. 54

Figure 9. Effects of fetuin-B on hMSCs migration and signaling-related... 56

Figure 10. Phenotypical characterization during adipogenic differentiation of... 58

Figure 11. Representative images showing SCA-1 expression altered in... 59

Figure 12. Effect of fetuin-B on viability in vascular smooth muscle cells. 61

Figure 13. Confirmation of PDGF-BB induced fetuin-B expression in vascular... 63

Figure 14. Time- and dose-dependent alteration of phosphorylation of Smad2... 65

Figure 15. Fetuin-B-induced nuclear translocation of phosphorylated Smad2/3... 67

Figure 16. Effects of TGF-β receptor inhibitor on Smad2 and Smad3... 69

Figure 17. Attenuation of TGF-β- or Fetuin-B-induced nuclear translocation of... 71

Figure 18. Effects of Fetuin-B on histone modification and PAI-1 expression. 73

Figure 19. Effects of fetuin-B on histone modification and MMP-2 expression 74

Figure 20. Effects of fetuin-B on vascular smooth muscle cells migration and... 76

Figure 21. Representative images showing atherosclerotic plaques after fetuin-B... 78

Figure 22. Schematic model of fetuin-B function in atherosclerotic plaque... 87

초록보기

 동맥경화 플라그의 파열은 심근경색으로 이어질 수 있어서 관상 동맥 혈전성 폐색의 주요 원인 중에 하나로 알려져 있다. 그러나, 플라크 파열에 대한 정확한 기전과 위험 요인들 사이의 인과관계 등은 아직 많은 부분이 불분명하게 남아 있는 실정이다.

따라서, 본 연구에서는 동맥경화병태에서의 플라크 파열에 영향을 미칠 수 있는 가능성을 가진 단백질을 탐색하기 위하여 단백체 분석법을 사용하여 급성 심근 경색(AMI) 및 안정형 협심증(SA) 환자의 혈청에 존재하는 미량의 단백질을 프로파일링 하였다. 그 결과 fibrinogen, fetuin-B, keratin 9, proapolipoprotein, fibrinogen 등 6 단백질의 발현이 안정형 협심증에 비해 급성 심근 경색 환자군에서 특히 두드러진 변화가 관찰되었다. 이들 단백질중 fetuin-B, proapolipoprtein, fibrinogen gamma-B chain precursors, fibrinogen 등은 안정형 협심증 환자군 보다 급성 심근 경색 환자군 에서 높은 발현을 보였다. 이들 급성 심근 경색 환자군 에서 증가된 발현을 나타낸 단백질 중에서 fetuin-B 단백질의 발현을 단백질전기영동을 통한 재차 확인에서 동일한 결과를 얻었다. 재조합 fetuin-B 단백질을 단핵구 세포, 대식세포, 중간엽줄기세포, 혈관 평활근 세포에 처리시 이들 세포의 유주능이 증가하였다. 특히 fetuin-B 단백질은 대식세포의 지질의 침착 및 사이토카인의 생산 증가, 단핵구 세포의 Matrix MetalloProteanse-2 단백질의 활성의 증가, 중간엽줄기세포의 지방세포로의 분화유도, 혈관 평활근 세포의 Matrix MetalloProteanse-2 단백질 활성 증가 및 세포사 증가 등의 다양한 반응을 활성화 하여 동맥경화 플라크의 안정성에 영향을 주는 것으로 나타났다. 동맥경화 플라크 파열 동물모델의 이용한 연구에서 fetuin-B 단백질을 모델동물에 투여한 결과 동맥경화 플라크 조직의 형태, 콜라겐의 축척 및 평활근 세포의 감소를 일으켰으며, 대식세포의 증가가 확인되었다. 더욱이 fetuin-B의 처리에 의해 Transforming growth factor-b receptor 하위 신호인 Smad2와 Smad3의 인산화가 유의성 있게 증가하였고, 또한 이를 통한 PAI-1과 MMP-2의 유전자 발현과 후생 유전학적 변화가 유도되었다. 게다가 이러한 변화된 반응들은 Transforming growth factor- receptor 신호의 선택적 억제제인 SB431542에 의해 유의성 있게 억제되었다. 이상의 결과로부터 fetuin-B는 급성 심근 경색의 발병에 조절 자로써 작용 가능성이 있으며, 이 작용은 Transforming growth factor- receptor을 통한 세포신호전달에 의해 진행될 지도 모른다는 사실이 시사되었다. 그러므로 본 연구는 고 위험성 급성 심근경색 환자에 대한 치료를 위한 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

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