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Title Page

Contents[내용누락;p.II]

ABBREVIATIONS 12

초록 14

GENERAL ABSTRACT 16

CHAPTER 1. The Role of autophagy during phytopathogen interaction between N. benthamiana and potato virus Y (PVYO)(이미지참조) 19

1.1. ABSTRACT 19

1.2. INTRODUCTION 21

1.3. MATERIALS AND METHODS 25

1.3.1. Plant materials and growth conditions 25

1.3.2. PVYO inoculation and sample collection(이미지참조) 25

1.3.3. Measurement of leaf length 25

1.3.4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 26

1.3.5. RNA extraction, cDNA synthesis and reverse-transcriptase PCR (RT-RCR) 26

1.3.6. Immunoblot analysis 27

1.3.7. Light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM) 28

1.3.8. Constructions of autophagy-related genes and production of transgenic plants 30

1.3.9. Statistical analysis 31

1.4. RESULTS 35

1.4.1. Developmented stage-dependent symptom changes of spreaded virus particles 35

1.4.2. Detection of PVY coat protein using western blot and immunolocalization 41

1.4.3. Morphological changes observed in top leaves after PVYO infection(이미지참조) 43

1.4.4. Observation and localization of micro-organelle and PVYO in upper leaves using TEM(이미지참조) 45

1.4.5. ROS production in tobacco plants after viral infection 50

1.4.6. Induction of antioxidant enzymes in the leaves of tobacco after virus infection 52

1.4.7. Change in hydrogen peroxide scavenging enzymes levels in response to virus infection 55

1.4.8. Expression of autophagy-related proteins in virus infected plants 57

1.4.9. Localization of autophagy-related protein 4 through cross-section of stem after virus infection 59

1.4.10. Expression pattern of RNA suppression-related genes 61

1.4.11. Expression levels of pathogen related protein 3 and chlorophyll binding protein in infected plants 63

1.4.12. Constructions for transgenic N. benthamiana including autophagy-related genes 65

1.5. DISCUSSION 69

1.6. REFERENCES 74

CHAPTER 2. Functional implication of autophagy in pepper fruits with anthracnose fungus 80

2.1. ABSTRACT 80

2.2. INTRODUCTION 82

2.3. MATERIALS AND METHODS 86

2.3.1. Plant materials 86

2.3.2. Colletotrichum gloeosporioides culture and inoculation 86

2.3.3. Immunoblot analysis 86

2.3.4. Light microscopy (LM) 87

2.3.5. RNA extraction, cDNA synthesis and qPCR 88

2.4. RESULTS 91

2.4.1. Cultivation of C. gloeosporioides for inoculation of pepper fruit 91

2.4.2. C. gloeosporioides invasion into the fruits and response the cell according to accumulate of ROS generation 94

2.4.3. Identification of ROS in C. gloeosporioides infection by NBT and DAB staining 96

2.4.4. SDS-PAGE and western blot analysis for defense mechanisms of green and red pepper after C. gloeosporioides infection 98

2.4.5. Monitoring ER stress-related and Autophagy-related genes in infected fruits 100

2.4.6. Localization of ER stress marker and ATG4 protein in infected fruits 104

2.4.7. Expression of pathogen-related proteins in infected fruits 107

2.5. DISCUSSION 110

2.6. REFERENCES 113

List of Tables

Table 1.1. Nicotiana benthamiana gene-specific primers used in RT-PCR 32

Table 1.2. PCR primers used for Nicotiana benthamiana ATG4 and ATG8 gene... 33

Table 1.3. Primary antibody informations used in western blot 34

Table 1.4. Secondary antibody informations used in western blot 34

Table 2.1. Capsicum annuum gene-specific primers used in qPCR 90

List of Figures

Figure 1.1. Symptom development caused by Potato virus Y-O (PVYO) in...(이미지참조) 37

Figure 1.2. Growth retardation in young leaves caused by Potato virus Y-O... 38

Figure 1.3. Developmental process of leaves after PVYO infection in Nicotiana...(이미지참조) 39

Figure 1.4. Relative amount of virus in the leaves of Nicotiana benthamiana... 40

Figure 1.5. PYY coat protein (CP) accumulation in Nicotiana benthamiana plants... 42

Figure 1.6. Anatomical structure of systemic leaves in Nicotiana benthamiana... 44

Figure 1.7. Transmission electron micrographs of cytoplasmic inclusions in the... 47

Figure 1.8. Transmission electron micrographs of cytoplasmic inclusions in chloroplasts... 48

Figure 1.9. Transmission electron micrographs of autophagosomes in healthy leaves... 49

Figure 1.10. Detection of superoxide accumulation in infected leaves of N.... 51

Figure 1.11. Effect of PVYO on antioxidant enzymes in systemic leaves of N....(이미지참조) 54

Figure 1.12. Effect of PVYO on antioxidant enzymes in systemic leaves of N....(이미지참조) 56

Figure 1.13. Effect of PVY on Autophagy-related proteins in systemic leaves of N.... 58

Figure 1.14. Immunolocalization of ATG4 in the stem of N. benthamiana infected... 60

Figure 1.15. KT-PCR analysis of viral defense related genes in the leaves of N.... 62

Figure 1.16. Effect of PVYO on pathogenesis related protein 3 (PR3) in systemic...(이미지참조) 64

Figure 1.17. Alignment of amino acid sequences of autophagy-related gene 5... 66

Figure 1.18. Alignment of amino acid sequences of autophagy-related gene 8... 67

Figure 1.19. Constructions of autophagy relative genes of N. benthamiana in binary... 68

Figure 2.1. In vitro germination and appressorium formation of C. gloeosporioides 92

Figure 2.2. Disease development on the unripe green and the ripe red fruits... 93

Figure 2.3. Ripening dependent antioxidant activity in the fruits of Capsicum... 95

Figure 2.4. Generation of superoxide and hydrogen peroxide in the epideimis of... 97

Figure 2.5. Fungal induced expression of antioxidant enzymes in unripe green fruit... 99

Figure 2.6. Fungal induced expression of autophagy related protein in unripe green... 101

Figure 2.7. Expression level of autophagy component genes in green and red fruits... 102

Figure 2.8. Expression level of UPR pathway components in green and red fruits... 103

Figure 2.9. Immunolocalization of BIP in the unripe and ripe fruits of Capsicum annuum... 105

Figure 2.10. Immunolocalization of ATG4 in the unripe and ripe fruits of Capsicum... 106

Figure 2.11. Fungal induced expression of pathogenesis related protein in unripe... 108

Figure 2.12. Expression level of pathogen-related genes in green and red fruits... 109

초록보기

 Autophagy는 식물에서 병원체의 침임에 대항하기 위한 면역적 방어기작에 필수적으로 요구된다. 병원체 침입 시, 식물은 즉각적으로 autophagy, apoptosis, necrosis와 같은 면역 기작을 작동시켜 세포내로 병원체의 감염이 이뤄지는 것을 막는다. 그러나 병원체 또한 그들의 생존에 필요한 기작들을 활성화 시켜 식물 방어 체계를 회피하여 살아남는다. 많은 과학자들은 병원체와 식물체 간의 autophagy와 같은 면역적 상호연관관계를 밝히고자 노력해왔다. 그 결과, 많은 부분에 대해서 궁금증을 해결 할 수 있었지만, 아직 일부 병원체와의 연관 관계를 밝히지는 못하였다.

본 연구는 potato virus Y-O(PVYo)와 Nicotiana benthamiana, Colletotrichum gloeosporioides (C. gloeosporioides)와 고추 열매와의 상호연관관계를 입증했다. PVYo와 N. benthamiana와의 상호연관관계를 밝히기 위해서 N. benthamiana에 직접 PVYo를 감염시켜 형태학적 분자생물학적 분석을 진행하였다. 형태학적 분석을 위해서 4 주차의 식물에 PVYo를 감염을 시킨 후 시간 별 사진을 비롯 하여 잎의 길이 측정, 병징 관찰, ELISA를 이용한 virus 입자의 생성 관찰, transmission electron microscope(TEM)와 light microscope(LM)를 이용하여 병징이 나타난 잎에서의 virus 분포도 관찰을 시행하였다. 분자생물학적 분석은 PYYo 감염 후에 잎의 위치에 따라 RT-PCR과 western blot을 통하여 RNA와 protein level에서의 변화를 관찰하였다.

C. gloeosporioides는 appressorium이라 불리는 자신의 미세기관을 이용하여 고추 열매에 부착하고 침입한다. 고추에 부착 후 침입이 이루어질 때, 고추는 병원체의 침입과 확산을 막기 위해 autophagy과 같은 다양한 방어기작을 일으킨다. 본 연구에서는 C. gloeosporioides를 감염 시켰을 때 fungi와 고추열매를 염색하여 C. gloeosporioides의 appressorium 형태와 부착, 침입을 관찰하였다. 또한, wetern blot을 이용하여 C. gloeosporioides의 침입에 따른 분자생물학적 변화를 관찰하였다. 그 결과 C. gloeosporioides 감염 후에 시간이 지남에 따라 autophagy 관련 protein들의 level이 증가하였고 이와 연관된 방어 protein들의 level 또한 증가함을 확인 할 수 있었다.

결론적으로, PVYo또는 C. gloeosporioides가 식물에 감염이 되면 식물체의 방어기작을 유도한다. 여러 가지 방어기작 중, 병원체가 감염되었을 때 빠른 시간 내에 autophagy가 작동하여 식물체 내로 병원체가 확산되는 것을 방어한다. 이 실험에서는 autophagosome을 형성하는데 기여하는 ATG4, ATG8을 확인하였고, 병원체 침입 시 발생하는 ROS 제거를 위해 발생하는 여러가지 antioxidant enzyme의 발현을 확인하였다. 또한 pathogen 침입 시 발현되는 pathogen related protein을 확인하였다. Virus의 경우 virus genomic RNA를 silencing 시키기 위하여 small interfering RNA (siRNA)를 만든다. 이 과정에 있는 dicer like protein (DCL)과 argonaute (AGO)의 발현량을 확인하였다. 그 결과 virus의 감염시 시간이 지남에 따라 DCL과 AGO의 전사 level이 감소됨을 확인하였다. 이는 virus의 구성 요성 중 RNA silencing을 방해하는 요소가 있음을 암시한다.

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