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표제지
목차
서론 5
재료 및 방법 11
1. 사용 시약 11
2. 균주 및 플라스미드 11
3. 배지 및 균주의 배양 13
4. 대장균의 형질전환 15
5. DNA의 분리 및 조작 15
가. 플라스미드 DNA의 추출 및 정제 15
나. DNA의 조작 17
6. DNA 염기서열 결정 18
7. 전기영동 19
가. DNA의 전기영동 19
나. 단백질의 전기영동 20
8. 단백질의 정량 20
9. XylR 단백질의 정제 20
10. Mobility shift DNA-binding assay 21
가. 단백질 시료의 조제 21
나. xylA 프로모터 부위 DNA의 분리 및 방사선 표지 21
다. Binding reaction 및 PAGE 22
11. Polymerase chain reaction(PCR) 23
12. Xylose isomerase의 활성 측정 23
결과 25
1. 조절 단백질 XylR의 정제 25
가. 융합단백질 MBP-XylR의 추출 25
나. Amylose affinity column chromatography 25
다. Factor Xa protease를 이용한 융합단백질 MBP-XylR의 절단 26
라. Q-Sepharose anion exchange column chromatography 26
2. 정제한 XylR의 xylA 프로모터와의 결합 능력 28
가. DNA probe의 준비 28
나. 정제한 XylR의 결합 능력 확인 및 결합에 미치는 xylose의 영향 29
다. xylose 첨가 농도별 및 정제 XylR의 농도별 결합강도 32
라. 정제 XylR과 crude cell extract의 binding 양상 비교 35
3. xylA 프로모터에서 조절 단백질 XylR의 결합부위 확인 37
가. 프로모터 deletion series를 이용한 결합 부위의 확인 37
나. PCR을 이용한 부분결손 프로모터의 제작 및 이를 이용한 XylR 결합 부위의 확인 40
1) PCR을 이용한 부분결손 프로모터의 제작 40
2) 부분결손 프로모터 단편을 이용한 XylR 결합부위의 확인 43
4. pMALR8 벡터 함유 대장균에서 glucose에 의한 xylose isomerase 생산의 억제 양상 47
고찰 49
요약 54
참고문헌 56
영문초록 62
Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study 12
Table 2. The composition of media used in this study 13
Tabel 3. PCR primers for xylA promoter deletion 41
Fig 1. Map of xylose operon in Escherichia coli 8
Fig. 2. SDS-PAGE of XylR protein during the purification procedures 27
Fig. 3. DNA sequences of xylA promoter in plasmid pUX30 29
Fig. 4. Mobility shift DNA binding assay with the purified XylR and the other proteins and a dissected 184bp fragment as DNA probe on 6% low ionic strength PAGE 30
Fig. 5. Effect of xylose and glucose on the mobility shift DNA binding assay with XylR protein and a dissected 184bp xylA promoter fragment as probe 31
Fig. 6. Mobility shift DNA binding assay with the increasing xylose 33
Fig. 7. Mobility shift DNA binding assay with the increasing XylR 34
Fig. 8. Mobility shift DNA binding assay with crude cell extract from JM109(XylR+) and DH60(XylR- ) and purified XylR 36
Fig. 9. DNA sequences of xylA promoter in plasmid pUX30 and its exonucleaseⅢ deletion plasmids 38
Fig. 10. Mobility shift DNA binding assay with dissected fragments from pUX30 to pUX34 deletion series of xylA promoter as probe 39
Fig. 11. Agarose gel electrophoresis after polymerase chain reaction(PCR) 41
Fig. 12. Schematic diagram of the pUXP36~40 vector 42
Fig. 13. The DNA sequences of xylA promoter in plasmid pUXP36~40 which were made by PCR 44
Fig. 14. Mobility shift DNA binding assay with dissected fragments from pUXP36 to pUXP40 as probe 45
Fig. 15. Mobility shift DNA binding assay with dissected fragments from pUX34 and pUXP36, 37 as probe 46
Fig. 16. Catabolite repression by glucose in pMALR8 transformants 48
Fig. 17. Homology comparison of AraC binding site in araoperon and XylR binding site in xylA promoter 53
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